《Advanced Science》：Lewis Pair-Engineered CuMnOx as Cold-Adapted Multinanozyme for Cooperative Hydrolytic and Oxidative Degradation of Raw Corn Stalk
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本文報道了一種通過構建同時引入錳空位和氧空位的缺陷型銅摻雜氧化錳納米酶（D-CuMnOx），從而創建路易斯酸-堿協同催化中心的創新策略。該納米酶兼備強效的水解糖苷鍵活性（如糖苷酶，GHs）與穩定的氧化酶樣活性，并表現出優異的冷適應性。研究表明，其獨特的缺陷結構形成的路易斯對能夠協同降低水解與氧化反應的能量壁壘，使其能夠在室溫和低溫條件下，協同作用于木質纖維素三大組分——纖維素、半纖維素和木質素的同步降解，為生物質全組分溫和高效轉化為增值化學品提供了具有前景的人工酶平臺。
1 引言
木質纖維素作為地球上最豐富的可再生碳資源，是替代化石原料生產生物燃料和高值化學品的理想選擇。然而，其由纖維素微纖絲嵌入半纖維素和木質素基質構成的高度交聯結構，使其天然抗拒降解，尤其是在溫和條件下的全組分利用方面。傳統的生物催化策略依賴微生物菌群或水解與氧化酶的雞尾酒療法，但面臨穩定性差、生產成本高，尤其在低溫下效率低下的挑戰。納米酶作為一類結合了高活性和操作穩定性的人工催化劑，為解決這些難題提供了新思路。然而，現有研究對水解型納米酶，特別是具有冷適應性的、以及能夠同時耦合水解與氧化功能的多家族系統關注甚少。
2 結果與討論
2.1 結構與缺陷表征
研究通過銅摻雜與非晶化工程相結合的策略，合成了缺陷型銅摻雜氧化錳納米酶（D-CuMnOx）。結構表征顯示其為片狀納米片。高分辨透射電鏡證實其內部同時存在非晶區和晶區。能量色散X射線光譜元素分布圖證明了銅（Cu）、錳（Mn）和氧（O）在納米片中的均勻分布。
3-FT Mn K-edge EXAFS spectra, (i) O1s XPS spectrum, (j) EPR spectrum, (k) CO2-TPD and (l) NH3-TPD profiles.">
X射線吸收光譜、X射線光電子能譜和電子順磁共振譜等分析強有力地證實了D-CuMnOx中同時存在錳空位（VMn）和氧空位（VO）。與僅含氧空位的對照樣（CuMnOx）相比，D-CuMnOx具有更高比例的VO。錳空位的引入導致電荷失衡，促使鄰近錳離子氧化，增加了Mn3+和Mn4+的比例，有利于增強氧化酶樣活性。程序升溫脫附實驗進一步證明，D-CuMnOx同時存在中等強度的路易斯酸位點和路易斯堿位點，而這些位點在CuMnOx中幾乎不存在。這些結果共同證實了D-CuMnOx中由缺陷誘導產生的路易斯酸-堿對位點。
2.2 D-CuMnOx的冷適應糖苷酶樣活性
受其與天然水解酶相似的路易斯對結構啟發，研究以對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）為模型底物，評估了D-CuMnOx的糖苷酶樣活性。結果表明，D-CuMnOx能夠高效切割pNPG的糖苷鍵，釋放對硝基苯酚（4-NP）。其催化活性比CuMnOx高出約4倍，并優于此前報道的多種錳基納米材料。
尤為突出的是，D-CuMnOx表現出優異的冷適應性能。當溫度從50°C降至-10°C時，其仍能保留約72.2%的催化效率，這是目前任何水解型納米酶所未報道過的特性。動力學分析表明，在0°C下，其米氏常數（Km）與37°C時相當，表明低溫下底物親和力得以保持。此外，D-CuMnOx對多種二糖（如纖維二糖、木二糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖）均表現出廣泛的底物水解能力，并能在0°C下保持顯著活性，證明了其廣譜、冷適應的水解能力。
2.3 糖苷酶樣與冷適應催化機制
同位素標記實驗證實了反應遵循水解途徑，水分子中的氧原子被整合到生成的葡萄糖中。通過吡啶和吡咯選擇性淬滅實驗，明確了路易斯酸位點和堿位點的協同作用對于D-CuMnOx的高效催化至關重要。在低溫下，路易斯酸位點成為催化的主要驅動力。基于此，提出了一個雙位點催化機制：缺陷錳作為路易斯酸位點，質子化糖苷鍵氧原子；相鄰的氧或氧空位作為通用堿，去質子化親核水分子，協同促進糖苷鍵斷裂。
218O labeling and (b) mass spectra of glucose. Quenching experiments targeting different active sites (c) at low temperatures (d). (e) Proposed hydrolytic mechanism of D-CuMnOx. (f) Molecular models of CuMnOx (top) and D-CuMnOx (bottom). (g) Energy profile of the hydrolysis reaction on the surface of the nanozyme and the corresponding indeterminate.">
密度泛函理論計算為實驗觀察提供了理論支持。與僅含VO的CuMnOx相比，D-CuMnOx對pNPG的吸附能更低，且水解反應的整體能壘顯著降低，表明其提供了熱力學上更有利的反應路徑。
2.4 多糖降解
研究進一步評估了D-CuMnOx對纖維素和半纖維素（木聚糖）這兩種多糖的降解能力。3,5-二硝基水楊酸（DNS）法和葡萄糖檢測均證實了還原糖的生成。傅里葉變換紅外光譜顯示，處理后樣品中代表糖苷鍵C-O-C伸縮振動的1030 cm-1峰顯著減弱，表明多糖鏈斷裂。
核磁共振氫譜中出現了代表新生低聚糖或單糖質子的新峰。掃描電鏡觀察顯示，原本長條狀的纖維素纖維被破碎成小塊，致密的半纖維素結構也被破壞成不規則納米顆粒，并伴有顯著的重量損失。重要的是，這些結構變化在0°C下與37°C下基本一致，證明了D-CuMnOx即使在低溫下也能有效解聚多糖。
2.5 玉米秸稈中木質素、纖維素和半纖維素的同步降解
除了水解活性，高效的木質纖維素降解還需要氧化酶樣活性的協同貢獻。研究表明，D-CuMnOx對典型的漆酶樣底物（2,4-二氯酚）和氧化酶樣底物（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺）均具有催化氧化能力。以愈創木基甘油-β-愈創木基醚（GGE）為模型化合物的實驗證實，D-CuMnOx能有效裂解木質素中最豐富的β-O-4連接鍵。
利用D-CuMnOx先進的水解和氧化特性，研究評估了其在單一體系中對天然玉米秸稈三大組分的同步解聚潛力。處理后，秸稈在37°C和0°C下分別實現了35.7%和28.5%的重量損失轉化率。紅外和X射線衍射分析證實了木質素、半纖維素和纖維素的結構均被破壞。DNS法和葡萄糖檢測證實了還原糖和葡萄糖的生成。氣相色譜-質譜聯用分析鑒定出烷烴、醇、酸、醚、酯和酚類等多種產物，其中酸和醇占主導，揭示了水解與氧化共同作用的轉化過程。三維熒光光譜顯示了溶解性有機物組成的變化。掃描電鏡圖像直觀展示了秸稈從完整光滑的棒狀結構到破碎片段的形態轉變。總有機碳分析和三大組分質量平衡計算進一步定量證實了D-CuMnOx在寬溫度范圍內高效降解玉米秸稈各組分的能力，其中木質素的降解率最高。
基于以上結果，文章提出了一個模擬天然木質素降解酶系的氧化-水解協同機制：納米酶優先攻擊木質素中最不穩定的β-O-4鍵，引發自由基鏈式反應，導致木質素結構嚴重破壞；木質素的初始分解暴露出內部的纖維素和半纖維素，使得它們能夠被同步水解為可溶性糖和寡聚物。這種在溫和條件下的協同雙功能，實現了三大主要組分的同步降解。
3 結論
總而言之，本研究通過整合銅摻雜與非晶化工程，開發了一種冷適應多功能納米酶D-CuMnOx。其同時引入的錳空位和氧空位產生了缺陷誘導的路易斯酸-堿對，作為協同催化中心，使D-CuMnOx兼具水解與氧化活性，并擁有卓越的冷適應性。機理研究表明，路易斯對促進了質子轉移和水活化以裂解糖苷鍵。密度泛函理論計算揭示了其降低的能壘和優化的吸附態。因此，D-CuMnOx能在0°C下催化二糖和多糖的廣譜水解，并進一步驅動原始玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質素的同步解聚。這項工作不僅為設計具有集成冷適應功能的多納米酶建立了概念框架，也為實現木質纖維素全組分利用及綠色生物轉化為高值化學品開辟了新途徑。
