膿毒癥相關(guān)急性腎損傷（SAKI）是危重癥患者中發(fā)病率和死亡率均較高的嚴重疾病，其病理機制復(fù)雜，涉及過度的氧化應(yīng)激和免疫炎癥失調(diào)。中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）的異常形成和先天性免疫的持續(xù)激活是加重腎損傷的關(guān)鍵因素。脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的膿毒癥會引發(fā)劇烈的炎癥和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致活性氧（ROS）過量產(chǎn)生和細胞損傷。傳統(tǒng)抗氧化劑和酶療法因穩(wěn)定性差、催化活性不足而受限。納米酶，如Mn₃O₄，因其類酶活性和良好的生物相容性，展現(xiàn)出應(yīng)用潛力。然而，單純清除ROS不足以完全逆轉(zhuǎn)SAKI。研究表明，NETs釋放的細胞外DNA可作為病原相關(guān)分子模式，激活胞質(zhì)DNA感受器cGAS，進而觸發(fā)cGAS-STING信號通路，產(chǎn)生I型干擾素和促炎細胞因子，加劇炎癥環(huán)境。因此，同時靶向ROS和NETs，并調(diào)節(jié)下游免疫信號，是治療SAKI的新策略。脫氧核糖核酸酶I（DNase-1）能有效降解NETs的DNA骨架。受此啟發(fā)，本研究開發(fā)了一種多功能的中性粒細胞仿生納米清除劑（MD@NM）。

通過分析SAKI患者及小鼠模型的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，SAKI組NETs形成評分和中性粒細胞活化顯著升高。腎組織RNA測序顯示，LPS處理組與假手術(shù)組之間存在大量差異表達基因。主成分分析和熱圖分析均表明SAKI模型存在顯著的炎癥轉(zhuǎn)變。基因本體和京都基因與基因組百科全書富集分析揭示，NETs形成、DNA感知和cGAS-STING信號通路在LPS組腎臟中被顯著激活。這些通路之間存在強關(guān)聯(lián)性，表明NETs通過釋放細胞外DNA，可能通過激活cGAS-STING軸加劇炎癥。免疫熒光分析進一步證實，LPS組腎組織中存在廣泛的NETs積累。

MD@NM由裝載DNase-1的Mn₃O₄納米酶核心（MD NPs）包裹中性粒細胞膜構(gòu)成。透射電鏡顯示Mn₃O₄納米酶呈單分散球形，MD@NM具有清晰的核殼結(jié)構(gòu)。元素映射證實了Mn、O、N、P、S元素的均勻分布。X射線光電子能譜和X射線衍射分析表明，功能化過程未改變錳的氧化態(tài)和Mn₃O₄的晶體結(jié)構(gòu)。傅里葉變換紅外光譜驗證了Mn₃O₄、DNase-1和膜組分的整合。電泳實驗證明MD@NM能有效降解DNA，表明DNase-1活性得以保留。蛋白質(zhì)印跡分析證實了關(guān)鍵趨化和粘附相關(guān)膜蛋白的保留。MD@NM展現(xiàn)出多重的ROS清除活性，包括超氧化物歧化酶樣活性、過氧化氫酶樣活性、分解H₂O₂釋放O₂以及清除羥基自由基的能力。3O₄納米酶的TEM圖像；(b) MD@NM的TEM圖像；(c) MD@NM的元素映射；(d-e) XPS譜圖；(f) XRD圖譜；(g) FTIR光譜；(h) 粒徑和Zeta電位；(i) 瓊脂糖凝膠電泳；(j) SDS-PAGE蛋白分析；(k) 膜蛋白保留的蛋白質(zhì)印跡驗證；(l-o) ROS清除能力評估。">

在LPS誘導(dǎo)的氧化損傷體外模型中，MD@NM展現(xiàn)出優(yōu)異的細胞保護作用。細胞活性檢測和活死細胞染色表明，MD@NM能顯著減輕LPS引起的細胞死亡，并有效恢復(fù)細胞活性。共聚焦顯微鏡和流式細胞術(shù)分析顯示，中性粒細胞膜偽裝顯著增強了MD@NM被炎癥狀態(tài)下的腎小管上皮細胞的識別與內(nèi)吞效率。膜上的CXCR2和LFA-1分子介導(dǎo)了這種主動靶向行為。此外，MD@NM能顯著降低LPS誘導(dǎo)的細胞凋亡率。通過DCFH-DA探針檢測發(fā)現(xiàn)，MD@NM處理能有效降低細胞內(nèi)的ROS水平。

在LPS刺激下，中性粒細胞釋放大量胞外DNA，形成NETs。SYTOX Green染色顯示，MD@NM能最有效地減少胞外DNA的釋放。免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果進一步證實，MD@NM處理顯著降低了NETs標志物（如瓜氨酸化組蛋白H3和髓過氧化物酶）的表達水平以及NETs相關(guān)酶的含量。

MD@NM通過降解NETs來源的DNA，減少了胞質(zhì)中雙鏈DNA的積累，從而抑制了cGAS-STING信號通路的激活。蛋白質(zhì)印跡分析表明，MD@NM處理顯著下調(diào)了cGAS、STING、磷酸化STING、IRF3和磷酸化IRF3的表達。這種信號抑制導(dǎo)致巨噬細胞極化表型的轉(zhuǎn)變：促炎的M1型巨噬細胞減少，而抗炎的M2型巨噬細胞增加。細胞因子檢測結(jié)果顯示，MD@NM處理降低了促炎因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）的分泌，同時升高了抗炎因子IL-10的水平。

在LPS誘導(dǎo)的SAKI小鼠模型中，靜脈注射MD@NM后，離體熒光成像顯示其能主動靶向并大量積聚在受損的腎臟，其腎臟積累量顯著高于未包裹膜的MD納米顆粒。MD@NM治療顯著改善了腎臟的外觀腫脹和充血。組織學分析顯示，MD@NM減輕了腎小管損傷、腫脹和管型形成，恢復(fù)了刷狀緣的完整性。同時，MD@NM治療顯著降低了反映腎功能的血清肌酐和血尿素氮水平，并減少了腎臟中促炎趨化因子CXCL1和CXCL2的表達。

MD@NM展現(xiàn)出多方面的免疫治療作用。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法和免疫組織化學分析表明，MD@NM能顯著減少腎小管上皮細胞的凋亡。免疫熒光顯示，MD@NM處理減少了腎臟中中性粒細胞的浸潤和NETs的形成。同時，MD@NM促進了巨噬細胞從促炎的M1表型向抗炎的M2表型轉(zhuǎn)變。流式細胞術(shù)分析證實了腎臟中Ly6G陽性中性粒細胞數(shù)量的減少。血清細胞因子檢測表明，MD@NM能系統(tǒng)性地抑制促炎細胞因子的釋放，并提升抗炎因子IL-10的水平。

對MD@NM治療組和假手術(shù)組腎臟的RNA測序分析表明，MD@NM能顯著下調(diào)大量與炎癥相關(guān)的基因。主成分分析顯示，MD@NM組的轉(zhuǎn)錄譜更接近假手術(shù)組。基因本體和京都基因與基因組百科全書通路富集分析證實，MD@NM抑制了與NETs形成、cGAS-STING激活、I型干擾素反應(yīng)和先天免疫激活相關(guān)的通路。熱圖顯示NETs形成、氧化應(yīng)激、凋亡和炎癥相關(guān)的關(guān)鍵基因表達下調(diào)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)揭示了這些基因間的強關(guān)聯(lián)性。免疫熒光分析再次證實MD@NM處理后腎臟NETs幾乎消失。

一系列生物安全性評估表明MD@NM具有良好的生物相容性。血液生化指標和全血細胞計數(shù)未見明顯異常。主要器官的組織學檢查未發(fā)現(xiàn)損傷或炎癥浸潤。溶血率遠低于安全閾值。藥代動力學研究表明，錳元素在體內(nèi)隨時間逐漸清除。長期安全性評估也證實了其良好的生物相容性。

本研究成功開發(fā)了一種中性粒細胞膜仿生的多功能納米平臺。該平臺通過整合Mn₃O₄的ROS清除能力、DNase-1的NETs降解能力以及中性粒細胞膜的炎癥靶向能力，協(xié)同作用于SAKI的多個病理環(huán)節(jié)：緩解氧化應(yīng)激、抑制NETs形成、調(diào)節(jié)cGAS-STING通路、重編程巨噬細胞極化，最終有效減輕腎臟炎癥、促進功能恢復(fù)。MD@NM為膿毒癥誘導(dǎo)的器官損傷提供了一種有前景的納米免疫治療策略。