《Biochemistry Research International》：Noncatalytic Functions Are Required for MPO and PON1 in Modulating the Involvement of Monocytes and Endothelial Cells in Atherosclerosis
編輯推薦：
本研究揭示了HDL-MPO-PON1功能復合體中，MPO與PON1的蛋白質本身（非催化功能）在動脈粥樣硬化（ASCVD）病理過程中的重要作用。研究發現，MPO蛋白通過降低單核細胞（THP-1）的膽固醇流出，增強內皮細胞（HUVECs）的ICAM-1與E-選擇素表達，并激活單核細胞分泌促炎因子（IL-6、TNF-α），進而損害內皮微血管結構。相反，PON1蛋白則發揮對抗作用，但無法完全抵消MPO對黏附分子的誘導。這一發現為ASCVD的發病機制提供了新見解。
1. 引言
動脈粥樣硬化是心肌梗死的主要原因，其早期診斷至關重要。高密度脂蛋白（HDL）在動脈粥樣硬化中扮演核心角色，無論是數量上的減少還是功能上的受損，都是疾病形成的關鍵因素。值得注意的是，HDL、髓過氧化物酶（MPO）和對氧磷酶-1（PON1）形成了一個功能性三元復合物，其中PON1部分抑制MPO活性，MPO反過來部分使PON1失活。該復合物為HDL的功能調控提供了一個特定平臺。然而，MPO的催化活性依賴于過氧化氫濃度，而血清中極低的過氧化氫濃度嚴重限制了其活性。PON1則擁有有機磷酸酯酶、芳基酯酶和硫代內酯酶活性，但這些水解酶活性與抗氧化應激無關。因此，我們提出假說，MPO和PON1可能通過其作為蛋白質的非催化功能，而非酶活性，參與動脈粥樣硬化過程。本研究旨在利用患者血清和細胞培養模型，探究MPO和PON1的非催化蛋白功能，以明確它們在動脈粥樣硬化過程中的膽固醇流出、單核細胞活化和內皮功能障礙中的作用。
2. 方法
本研究納入了20名ASCVD患者和20名年齡、性別匹配的健康對照者。通過膽固醇流出實驗、ATP結合盒轉運體A1（ABCA1）依賴性膽固醇流出實驗和卵磷脂膽固醇酰基轉移酶（LCAT）活性測定，評估了MPO、PON1以及來自ASCVD患者和健康個體的血清對人急性單核細胞白血病細胞系（THP-1細胞）膽固醇流出的影響。利用重組蛋白和中和抗體分析了MPO和PON1的非催化功能。通過傷口愈合實驗和血管形成實驗，分析了MPO和PON1的非催化功能在調控人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）參與中的作用。此外，還利用蛋白質印跡和ELISA等方法檢測了相關蛋白及炎癥因子的表達。
3. 結果
3.1. PON1通過其非催化功能對抗MPO在膽固醇流出中的作用
與ASCVD患者的血清相比，健康個體的血清顯著增加了THP-1細胞的膽固醇流出。研究發現，重組MPO（rMPO）降低了THP-1細胞的膽固醇流出，而重組PON1（rPON1）則增加了膽固醇流出。重要的是，MPO抗體部分恢復了膽固醇流出，而PON1抗體則部分降低了膽固醇流出。此外，使用環孢素A降低ABCA1活性后，rMPO、rPON1或二者聯合處理所誘導的THP-1細胞膽固醇流出均被顯著抑制，表明ABCA1是MPO和PON1調控膽固醇流出所必需的。然而，rMPO、rPON1蛋白以及二者的組合并未調節LCAT的活性。
3.2. PON1與MPO的非催化功能與內皮細胞功能障礙無直接關聯
研究發現，rMPO、rPON1及其組合并未顯著改變HUVECs的活力。然而，rPON1能夠逆轉rMPO所抑制的HUVECs遷移，表明在細胞遷移中存在PON1與MPO非催化功能的對抗。同時，rMPO增強了HUVECs的細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和E-選擇素的表達，而rPON1則降低了這些黏附分子的表達。值得注意的是，rMPO與rPON1聯合產生的黏附分子表達水平與單獨使用rMPO相似，表明PON1無法平衡MPO對這些黏附分子的誘導作用。
3.3. MPO蛋白誘導的單核細胞活化通過增加由NF-κB p65調控的IL-6和TNF-α表達直接損害體外微血管結構
研究發現，rMPO觸發了THP-1細胞的白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達與分泌。來自rMPO處理的THP-1細胞的上清液顯著損害了HUVECs的血管形成能力。機制上，rMPO顯著上調了NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）的水平。敲低NF-κB p65則顯著下調了IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平，表明NF-κB是rMPO處理THP-1細胞中IL-6和TNF-α表達所必需的。
4. 討論
酶的非催化功能，包括競爭蛋白質相互作用、對其他酶變構效應等，在代謝、調控通路和疾病發生中發揮作用。本研究揭示了MPO和PON1的非催化功能在動脈粥樣硬化中調控單核細胞的作用。在HDL-MPO-PON1三元復合物中，由于血清中過氧化氫濃度極低嚴重限制了MPO的催化活性，因此該復合物在從初始到穩定動脈粥樣硬化斑塊過程中，MPO的主要作用可能是其非催化功能。同樣，PON1的生理相關底物尚不明確，其水解酶活性也不一定代表其生理活性。MPO蛋白增加了基于MPO蛋白與PON1蛋白比例的ASCVD風險評估的真陽性率，進一步證實了這些酶的非催化功能在動脈粥樣硬化中的作用。本研究發現，MPO的非催化功能能夠上調內皮細胞黏附分子的表達，為單核細胞提供募集“利基”。因此，MPO的非催化功能以間接模式參與募集單核細胞；而PON1的非催化功能則與之對抗。研究還發現，MPO的非催化功能顯著上調了IL-6和TNF-α的釋放，活化的單核細胞進而導致內皮細胞功能障礙，這一過程依賴于NF-κB p65。出乎意料的是，PON1的非催化功能未能對抗MPO的此作用。綜上所述，MPO和PON1的非催化功能參與調控動脈粥樣硬化中的單核細胞，為理解MPO和PON1在動脈粥樣硬化中的作用開辟了新維度。本研究存在樣本量較小、患者群體異質性、實驗模型不能完全反映天然HDL顆粒復雜性等局限性。盡管如此，這一發現為開發針對MPO或PON1脫輔基酶的中和抗體或小分子抑制劑提供了具有轉化前景的新思路。
