基于核殼量子點(diǎn)的側(cè)向流動(dòng)條帶，用于靈敏檢測(cè)大腸桿菌O157:H7和單核細(xì)胞增生李斯特菌，結(jié)合了RPA和Cas12a技術(shù)
《Microchemical Journal》：A core-shell quantum dots-based lateral flow strips for sensitive detection of
Escherichia coli O157:H7 and
Listeria monocytogenes combined with RPA and Cas12a
編輯推薦：
基于RPA-Cas12a-LFA的食品致病菌可視化快速檢測(cè)方法研究，建立了同時(shí)檢測(cè)E. coli O157:H7和Listeria monocytogenes的集成平臺(tái)，vLOD分別為29.0 fg/μL和25.1 fg/μL，檢測(cè)限達(dá)223 CFU/mL和19.5 CFU/mL，并驗(yàn)證了在真實(shí)食品樣本中的適用性。
曾海娟|李幽|周曉武|劉華|宋杰|朱樂(lè)梅|劉娟|冰萍萍|王金斌
上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)遺傳與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海農(nóng)業(yè)生物安全評(píng)估與檢測(cè)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，中國(guó)上海201106
摘要
大腸桿菌 O157:H7和單核細(xì)胞增生李斯特菌（大腸桿菌 O157:H7和LM）作為常見(jiàn)的食源性病原體，感染后可引發(fā)多種疾病。早期和準(zhǔn)確的檢測(cè)在食品安全和人類健康中起著關(guān)鍵作用。本研究構(gòu)建了一種基于重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）、成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）系統(tǒng)以及自主研發(fā)的CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)（QDs）試紙的可視化檢測(cè)平臺(tái)，用于檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7和LM，該平臺(tái)稱為RPA-Cas12a-LFA。對(duì)于目標(biāo)DNA，大腸桿菌 O157:H7和LM的檢測(cè)限（vLODs）分別為29.0 fg/μL和25.1 fg/μL；對(duì)于目標(biāo)細(xì)菌，大腸桿菌 O157:H7和LM的檢測(cè)限（vLODs）分別為223 CFU/mL和19.5 CFU/mL。定量限（LOQs）分別為2.93 fg/μL和2.62 fg/μL（針對(duì)DNA）以及2.26 CFU/mL和2.03 CFU/mL（針對(duì)細(xì)菌）。此外，該方法表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性，且未與其他非目標(biāo)細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)。所提出的RPA-CRISPR-LFA成功應(yīng)用于實(shí)際食品樣本的直接檢測(cè)，表明其在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用中具有巨大潛力。
引言
食源性病原菌是導(dǎo)致嚴(yán)重傳染病（包括嘔吐、腹瀉、肺炎、敗血癥和細(xì)菌性痢疾）的主要原因，因此對(duì)人類健康和食品安全構(gòu)成重大挑戰(zhàn)。[1] 特別是大腸桿菌 O157:H7（大腸桿菌 O157:H7）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（LM），它們是廣泛存在于環(huán)境中的主要食源性病原體，能夠引發(fā)嚴(yán)重疾病。因此，準(zhǔn)確及時(shí)地檢測(cè)這些病原體對(duì)于有效預(yù)防疾病和控制疫情至關(guān)重要。微生物平板培養(yǎng)法被認(rèn)為是細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間（24–72小時(shí)），不適合快速和便攜式的檢測(cè)[2]。一些分子檢測(cè)方法，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)PCR和DNA測(cè)序已被用于微生物鑒定[3]，但這些技術(shù)需要專業(yè)環(huán)境、昂貴設(shè)備，并且對(duì)即時(shí)檢測(cè)（POCT）應(yīng)用存在挑戰(zhàn)。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏且簡(jiǎn)單的食源性病原體檢測(cè)方法對(duì)于食品安全監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。
重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）能夠在溫和溫度（37–42°C）或室溫下實(shí)現(xiàn)核酸的等溫?cái)U(kuò)增。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程迅速，通常在10分鐘內(nèi)即可產(chǎn)生可檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物，非常適合POCT檢測(cè)[4]。側(cè)向流動(dòng)分析（LFA）是現(xiàn)場(chǎng)病原體檢測(cè)中最常用的方法之一，因其速度快、操作簡(jiǎn)單、成本低、結(jié)果可視化且用戶友好而受到重視[5]。目前也有相關(guān)報(bào)道指出，通過(guò)將RPA擴(kuò)增的目標(biāo)序列與側(cè)向流動(dòng)試紙結(jié)合，可以可視化檢測(cè)食源性病原菌[6]。然而，對(duì)于陰性樣本，引物二聚體會(huì)在試紙上產(chǎn)生假陽(yáng)性條帶，增加了結(jié)果解讀的難度。
CRISPR-Cas系統(tǒng)是一類能夠精確切割DNA或RNA的RNA引導(dǎo)核酸酶，是細(xì)菌適應(yīng)性免疫的重要組成部分[7]。CRISPR-Cas12a的轉(zhuǎn)切割活性能夠在識(shí)別目標(biāo)后非特異性地降解單鏈核酸報(bào)告分子，這為其開(kāi)發(fā)高靈敏度核酸檢測(cè)平臺(tái)提供了重要基礎(chǔ)[8]。研究表明，RPA技術(shù)與CRISPR/Cas12a的DNA目標(biāo)識(shí)別和切割特性相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)超靈敏的檢測(cè)。同時(shí)，由于其信號(hào)轉(zhuǎn)換功能，CRISPR/Cas12a可以引入RPA-LFA系統(tǒng)中，以消除陰性樣本的假陽(yáng)性條帶。此外，RPA-CRISPR/Cas系統(tǒng)與其他技術(shù)（如微流控平臺(tái)）結(jié)合，也被用于病毒、病原菌等的快速并行檢測(cè)[9],[10]。
通常，基于膠體金（AuNPs）作為信號(hào)探針的免疫層析試紙?jiān)陟`敏度和非特異性結(jié)合問(wèn)題方面有待改進(jìn)[11],[12]。如今，各種納米材料引導(dǎo)的LFA被廣泛用于快速、靈敏和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)多種生物目標(biāo)。例如，已有報(bào)道將RPA-CRISPR/Cas與AuNPs或彩色微球結(jié)合的試紙用于快速、可視化和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物或食源性病原體[13],[14]。值得注意的是，量子點(diǎn)（QDs）作為示蹤劑具有高熒光量子產(chǎn)率和抗光降解能力等優(yōu)點(diǎn)[15]，可以提高LFA的靈敏度，并具有實(shí)際應(yīng)用的強(qiáng)大潛力。目前，尚未有基于RPA、CRISPR-Cas12a與QDs標(biāo)記的LFA結(jié)合的雙目標(biāo)靈敏可視化檢測(cè)方法的報(bào)道。
本研究建立了一種快速的RPA-CRISPR-LFA平臺(tái)，用于同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7（通過(guò)rfbE基因）和LM（通過(guò)hly基因）。通過(guò)羧基-氨基反應(yīng)合成了穩(wěn)定的熒光探針（CdSe/ZnS核殼QDs標(biāo)記抗體）。在該系統(tǒng)中，RPA用于目標(biāo)基因的預(yù)擴(kuò)增，CRISPR-LbaCas12a用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，LFA用于快速、靈敏和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)各種生物目標(biāo)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在50分鐘內(nèi)完成。RPA-CRISPR-LFA平臺(tái)成功驗(yàn)證了其對(duì)大腸桿菌 O157:H7和LM的同時(shí)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)能力，在添加了目標(biāo)菌的食品基質(zhì)和不同市場(chǎng)購(gòu)買的過(guò)期樣本中均表現(xiàn)出可靠的檢測(cè)效果。值得注意的是，該方法具有良好的線性相關(guān)性和可量化潛力�？傊�，我們的檢測(cè)平臺(tái)有助于快速檢測(cè)食品中的大腸桿菌 O157:H7和LM，從而為食源性疫情的早期干預(yù)提供了有效工具。
材料與試劑
引物、報(bào)告分子（雙標(biāo)記的單鏈DNA探針）和crRNA分別由Sangon（中國(guó)上海）合成。TIANamp Bacteria DNA Kit型號(hào)DP302、RPA檢測(cè)試劑盒、LbCas12a核酸酶和RNase抑制劑分別從Tiangen（中國(guó)北京）、TwistDx（美國(guó)馬薩諸塞州劍橋）、Tolo Biotech（中國(guó)上海）和BBI（中國(guó)上海）購(gòu)買。r-鏈霉親和素（r-SA）、牛血清白蛋白（BSA）、山羊抗小鼠IgG抗體（IgGm）和山羊抗兔IgG抗體
基于QDs的RPA-Cas12a-LFA同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7和LM的原理
如圖1A所示，RPA-CRISPR-LFA系統(tǒng)由三個(gè)主要部分組成：RPA擴(kuò)增、CRISPR-Cas12a切割反應(yīng)和試紙檢測(cè)。兩種類型的基于QDs的探針如圖1B所示設(shè)計(jì)。羧基化的QDs標(biāo)記的抗地高辛抗體用于大腸桿菌 O157:H7檢測(cè)，胺化的QDs標(biāo)記的抗FITC抗體用于LM檢測(cè)。簡(jiǎn)而言之，地高辛/FITC抗體和QDs通過(guò)縮合反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記
結(jié)論與討論
為了全面評(píng)估本研究中提出的基于QDs的RPA-Cas12a-LFA方法，表1展示了多種病原菌檢測(cè)方法�；赑CR的方法（編號(hào)1–2）具有較高的準(zhǔn)確性，但耗時(shí)較長(zhǎng)，需要熟練的操作人員和精密儀器。用于抗原檢測(cè)的LFA（編號(hào)3–4）具有檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果可見(jiàn)和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度相對(duì)較低。盡管RPA-LFA方法（編號(hào)5–8）具有較好的檢測(cè)效果
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
曾海娟：撰寫 – 審稿與編輯、監(jiān)督、方法學(xué)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)管理、概念構(gòu)思。李幽：撰寫 – 原始草稿、可視化處理、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)管理。周曉武：方法學(xué)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)實(shí)施。劉華：驗(yàn)證、數(shù)據(jù)分析。宋杰：驗(yàn)證、數(shù)據(jù)分析。朱樂(lè)梅：資源獲取、實(shí)驗(yàn)實(shí)施。劉娟：驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)實(shí)施。冰萍萍：撰寫 – 審稿與編輯、監(jiān)督、實(shí)驗(yàn)實(shí)施、資金籌集。王金斌：項(xiàng)目整體協(xié)調(diào)
利益沖突聲明
作者聲明沒(méi)有已知的財(cái)務(wù)利益或個(gè)人關(guān)系可能影響本文所述的工作。
致謝
本研究得到了上海 Rising-Star 計(jì)劃（編號(hào)23QB1403500）、SAAS人才項(xiàng)目（2026-2028年）、上海農(nóng)業(yè)生物安全評(píng)估與檢測(cè)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)（編號(hào)23DZ2290700）、上海農(nóng)業(yè)應(yīng)用技術(shù)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)I2024004）、湖南省教育廳基金（編號(hào)24A0683、25A0803）的支持。
