在全球范圍內，土壤鹽漬化問題日益嚴峻，超過10%的農業用地受到影響，嚴重威脅著糧食安全。蘋果（Malus × domestica）作為全球最重要的經濟果樹之一，恰恰對鹽脅迫相當敏感。鹽脅迫會破壞植物的生理過程，引發水分脅迫、特定離子（如鈉離子Na⁺和氯離子Cl^-）毒害、離子失衡、氧化損傷等一系列問題，最終導致生長受阻和果實品質下降。因此，探尋環境友好且高效的調控物質來緩解鹽脅迫，成為當前研究的重點。其中，5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）作為一種新型植物生長調節劑，因其在增強植物抗逆性方面的潛力而備受關注。先前研究表明，ALA能通過調控轉錄因子（如MdWRKY71）的表達，從氧化還原穩態、離子穩態、水分穩態和液泡功能等多個方面增強蘋果的耐鹽性。然而，相對于對Na⁺毒害緩解機制的研究，ALA如何減輕Cl^-特異性毒害作用的機制尚不清晰。此外，蛋白磷酸酶2A（Protein Phosphatase 2A， PP2A）在植物耐鹽性中扮演重要角色，但其是否以及如何參與ALA誘導的耐鹽性，特別是在調控Cl^-穩態方面，仍是一個未知領域。

為了回答上述問題，南京農業大學園藝學院的研究人員開展了一項深入的研究，系統探究了PP2A催化亞基MdPP2AC在ALA誘導蘋果耐鹽性中的功能與分子機制。相關成果發表在《Plant Physiology and Biochemistry》上。

研究人員綜合運用了多種關鍵技術方法來解析這一生物學過程。研究材料涵蓋了‘Gala’蘋果的離體葉片、愈傷組織、無根及有根組培苗，并構建了過表達（OE）和RNA干擾（RNAi）MdPP2AC的轉基因材料。為了驗證PP2A酶的功能，還使用了其特異性抑制劑斑蝥素（Cantharidin， CT）進行藥理學實驗。在分子機制探索層面，采用了酵母雙雜交（Y2H）、雙分子熒光互補（BiFC）、熒光素酶互補成像（LCI）等技術驗證蛋白質互作；通過定點突變和截斷實驗確定了互作關鍵位點；利用系統發育分析和實時定量PCR（RT-qPCR）鑒定了蘋果氯離子通道（MdCLC）基因家族并篩選了關鍵成員；通過酵母Δgef1突變體互補實驗驗證了MdCLC-c2和MdPP2AC在細胞水平的功能協同性；此外，還使用了氯離子熒光探針（MQAE）和Evans Blue染色等技術進行生理和細胞學觀測。

研究結果揭示了ALA通過MdPP2AC-MdCLC-c2模塊調控氯離子穩態從而增強蘋果耐鹽性的新機制。

鹽脅迫（200 mM NaCl）顯著損傷蘋果無根苗葉片，而ALA預處理能有效緩解這種損傷，維持較高的葉綠素含量。同時，鹽脅迫誘導了PP2A酶活性，ALA處理進一步增強了該活性。基因表達分析發現，在MdPP2AC基因家族的10個成員中，只有MdPP2AC（LOC103451899）的表達受鹽脅迫誘導，且ALA處理能進一步顯著上調其表達。啟動子活性分析（GUS染色）也證實，鹽脅迫激活了MdPP2AC啟動子，而ALA能協同增強這種激活。這些結果表明，MdPP2AC是ALA和鹽脅迫共同調控的候選基因，可能介導了ALA增強的耐鹽性。

利用過表達MdPP2AC的轉基因蘋果葉片和PP2A抑制劑CT處理的野生型葉片進行實驗。結果顯示，過表達MdPP2AC顯著緩解了NaCl脅迫引起的葉片損傷和葉綠素降解，而CT處理則加劇了傷害，ALA預處理能部分緩解CT加重的不利影響。在生理指標上，過表達MdPP2AC提高了鹽脅迫下超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性，降低了過氧化氫（H₂O₂）、超氧陰離子（O₂^•ˉ）和丙二醛（MDA）的積累，同時促進了脯氨酸的積累。相反，CT處理則抑制了抗氧化酶活性和脯氨酸積累，加劇了氧化損傷。這些數據充分證明，MdPP2AC是ALA增強蘋果葉片耐鹽性的正調控因子。

在‘Orin’蘋果愈傷組織中，過表達MdPP2AC提高了其在鹽脅迫下的鮮重，而RNA干擾MdPP2AC則降低了鮮重，ALA處理能緩解所有基因型的生長抑制。與葉片結果一致，過表達MdPP2AC增強了鹽脅迫下的抗氧化酶活性，抑制了活性氧和MDA積累，而RNAi則表現出相反的趨勢。更重要的是，過表達MdPP2AC促進了愈傷組織中Cl^-的積累，且ALA能進一步增強這一效應，而RNAi則降低了Cl^-含量。這表明MdPP2AC通過促進Cl^-積累和增強抗氧化能力來正調控ALA誘導的耐鹽性。

在有根蘋果植株實驗中，過表達MdPP2AC增強了植株整體耐鹽性，表現為葉片傷害減輕、葉綠素和相對含水量（RWC）維持較高水平、抗氧化能力增強。離子含量測定發現，過表達MdPP2AC顯著降低了鹽脅迫下葉片中的Cl^-含量，但大幅提高了根中的Cl^-含量。CT處理則得到相反的結果：葉片Cl^-增加，根中Cl^-減少。ALA處理能降低各基因型葉片Cl^-，同時增加根中Cl^-。利用MQAE熒光探針觀察根尖成熟區，直觀證實了過表達MdPP2AC和ALA處理能促進Cl^-在根中的積累，而CT處理抑制了這一過程。因此，MdPP2AC和ALA通過促進Cl^-在根中滯留（區隔化），減少其向地上部轉運，從而避免葉片遭受Cl^-毒害。

研究人員從蘋果基因組中鑒定出11個MdCLC基因，分為6個亞家族（b-g）。表達譜分析篩選出4個受MdPP2AC和ALA正調控的候選基因：MdCLC-b1、MdCLC-c1、MdCLC-c2和MdCLC-d1。它們的表達在過表達MdPP2AC根中被上調，在CT處理根中被下調，且ALA能進一步促進其表達。

通過酵母雙雜交、熒光素酶互補成像和雙分子熒光互補實驗，證實MdPP2AC能夠與MdCLC-c2直接相互作用，而與MdCLC-b1的互作很弱，與MdCLC-c1不互作。亞細胞定位實驗表明，MdCLC-c2是一個定位于液泡膜的蛋白。這為二者在液泡膜上協同調控Cl^-轉運提供了可能。

通過蛋白質結構預測和截斷實驗，發現MdPP2AC與MdCLC-c2的互作依賴于MdCLC-c2的C端區域（第540-758位氨基酸）和一個較短片段（第489-539位氨基酸）。序列比對和定點突變實驗進一步鎖定，位于MdCLC-c2 C端CBS結構域的第684位谷氨酸（Glu⁶⁸⁴）對于其與MdPP2AC的互作是必不可少的。將該位點突變為丙氨酸（Ala）后，二者的互作完全喪失。

在酵母Δgef1突變體（缺乏內源氯離子通道基因GEF1）中，異源表達蘋果的MdCLC-c2可以部分恢復其對鹽脅迫的耐受性。而共表達MdCLC-c2和MdPP2AC能產生協同效應，顯著增強酵母的耐鹽性。在培養基中添加ALA能進一步促進這種耐鹽表型。相應地，Cl^-含量測定顯示，共表達MdCLC-c2和MdPP2AC的酵母細胞積累了最多的Cl^-，且ALA處理能顯著增加這種積累。這直接證明了MdCLC-c2具有氯離子通道功能，且其與MdPP2AC的互作能協同促進Cl^-的積累，這一過程可被ALA增強。

歸納研究結論與討論部分，本研究系統闡明了ALA增強蘋果耐鹽性的一個新機制。研究發現，鹽脅迫和ALA共同誘導蘋果PP2A催化亞基MdPP2AC的表達與酶活性。功能研究表明，MdPP2AC是ALA誘導耐鹽性的正調控因子，其作用至少涉及兩個方面：一是增強抗氧化酶系統活性以緩解氧化損傷；二是促進Cl^-在根組織細胞液泡中的區隔化，減少毒性離子向地上部的運輸，從而維持離子穩態。分子機制上，MdPP2AC通過其與液泡膜氯離子通道蛋白MdCLC-c2的直接物理互作來發揮后一功能，其中MdCLC-c2第684位的谷氨酸殘基是互作的關鍵位點。在酵母系統中的驗證實驗進一步支持了MdPP2AC與MdCLC-c2在功能上的協同性以及ALA的增效作用。

這項研究的意義在于，首次在蘋果中建立了從ALA信號到PP2A磷酸酶，再到氯離子通道蛋白的完整信號傳導鏈條，揭示了轉錄后修飾（如去磷酸化）調控離子通道功能以應對鹽脅迫的新途徑。它加深了我們對植物如何利用ALA這類環境友好型調節劑來整合抗氧化防御和離子穩態機制以應對非生物脅迫的理解。所發現的MdPP2AC和MdCLC-c2基因為通過分子育種手段培育耐鹽性更強的蘋果品種提供了有價值的候選基因和理論靶點。