《Poultry Science》：A Novel PLGA-based Nano-adjuvant Augments Mucosal and Systemic Immunity in Chicks through Intestinal targeting and IgA Production
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為應對H9N2禽流感病毒持續傳播對疫苗免疫效力的挑戰，本研究開發了一種新型多免疫調節佐劑PEI-LSP-RA-PLGA。該研究利用雙層納米粒技術，將葫蘆多糖(LSP)與視黃酸(RA)封裝于聚乙烯亞胺(PEI)修飾的PLGA納米粒中，制備出PEI-LSP-RA-PLGA納米佐劑。實驗表明，該佐劑與H9N2滅活疫苗聯用，可顯著提升雛雞血清IgG與腸道IgA抗體水平，并促進多種細胞因子分泌、增強免疫器官功能、改善小腸結構。體內成像證實其具有優異的注射部位緩釋與長期腸道靶向能力，測序與驗證實驗揭示其通過CCL20/CCL25趨化因子作用下的CCR9與CCR6信號通路實現腸道靶向，繼而通過Toll樣受體、NOD樣受體通路及IgA產生免疫網絡誘發有效黏膜免疫。該佐劑為同時誘導長效全身免疫與腸道黏膜免疫的多靶點疫苗佐劑，展現出提升疫苗效力的巨大應用潛力。
禽流感病毒，尤其是H9N2亞型，雖屬于低致病性病毒，卻因其可通過呼吸道和消化道侵入禽類宿主，并在感染后定植于腸道上皮、通過糞便排毒擴散，持續對家禽業構成嚴重威脅。目前，腸道黏膜免疫被廣泛認為是預防H9N2感染最有效的防御策略。然而，現有的滅活疫苗和減毒活疫苗存在一個關鍵短板：它們雖能誘導強大的體液和細胞免疫應答，卻無法引發有效的黏膜免疫。盡管核酸疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗平臺近年來發展迅速，但在免疫原性和穩定性方面仍存在不足。傳統的疫苗佐劑，如鋁佐劑和角鯊烯基佐劑（MF59、AS03等），也存在免疫應答類型有限、缺乏有效細胞免疫或黏膜免疫等問題。因此，開發能夠誘導黏膜免疫混合應答的安全有效疫苗佐劑，對于提升H9N2疫苗的免疫效力至關重要。
在此背景下，新疆農業大學的研究團隊將目光投向了生物可降解材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)。PLGA是一種經美國FDA認證的安全聚合物載體。研究團隊設想，能否以PLGA納米粒為載體，同時負載具有免疫增強活性的葫蘆(Lagenaria siceraria)多糖(LSP)和具有腸道歸巢誘導功能的視黃酸(RA)，并通過聚乙烯亞胺(PEI)進行表面修飾，構建一種新型納米佐劑，從而整合各方優勢，在激發持久全身免疫的同時，誘導有效的腸道黏膜免疫？這項研究最終以論文形式發表在《Poultry Science》期刊上。
為驗證這一設想，研究人員主要運用了以下幾項關鍵技術方法：首先，采用水包油包水(W/O/W)溶劑揮發法制備了同時封裝LSP和RA的PLGA納米粒，并通過PEI表面修飾獲得帶正電的PEI-LSP-RA-PLGA納米佐劑。其次，以一日齡三黃公雞為動物模型，設置了包括PEI-LSP-RA-PLGA/H9N2、傳統鋁佐劑/H9N2、單獨抗原等多個實驗組進行免疫實驗。第三，綜合運用透射/掃描電鏡、馬爾文粒徑分析儀進行納米粒表征；通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清特異性IgG、腸道IgA抗體及多種細胞因子水平；通過流式細胞術分析脾臟T淋巴細胞亞群分化；通過蘇木精-伊紅(H&E)和過碘酸雪夫(PAS)染色觀察免疫器官及腸道組織形態學變化；利用活體熒光成像系統監測納米佐劑在體內的分布與靶向情況；最后，通過轉錄組測序、實時熒光定量PCR(qPCR)及免疫組織化學(IHC)等技術，從基因和蛋白水平深入探究其作用機制。
研究結果
PEI-LSP-RA-PLGA的表征與抗原吸附效果
表征結果顯示，制備的PEI-LSP-RA-PLGA納米粒呈近似球形，粒徑約230納米，在液體系統中21天內保持良好的穩定性。其對LSP、RA和H9N2抗原的封裝效率分別為58.5%、69%和62.6%，并能實現H9N2抗原長達30天的緩釋效果。
特異性抗體與細胞因子結果
免疫實驗表明，PEI-LSP-RA-PLGA/H9N2組能顯著提升雛雞血清中H9N2特異性IgG和腸道中特異性IgA的水平。與對照組相比，IgG增加了132.83%，IgA增加了115.12%。同時，該組血清中Th1型細胞因子(如IFN-γ、IL-12)和Th2型細胞因子(如IL-4、IL-5、IL-10)的分泌水平也顯著升高，表明該佐劑能全面激活體液和細胞免疫。
免疫器官指數結果
PEI-LSP-RA-PLGA/H9N2組雛雞的脾臟、胸腺和法氏囊指數均顯著高于抗原單獨免疫組，表明確切的免疫刺激作用。組織病理學觀察未發現炎癥或病理改變，證明了其良好的安全性。該佐劑處理組的胸腺小葉面積更大，法氏囊淋巴濾泡區域增加，脾臟濾泡增多，盲腸扁桃體上皮細胞排列更緊密有序，顯示出免疫器官功能增強。
脾臟T淋巴細胞活化結果
流式細胞術分析顯示，PEI-LSP-RA-PLGA/H9N2組雛雞脾臟中CD3+、CD4+和CD8+T細胞的比例均顯著升高，表明該納米佐劑能有效激活T淋巴細胞，并促進其向輔助性T細胞(Th)和細胞毒性T細胞(CTL)分化。
腸道組織形態與杯狀細胞分析
H&E染色顯示，PEI-LSP-RA-PLGA/H9N2組雛雞十二指腸絨毛長度顯著增加，隱窩深度減小，絨毛長度/隱窩深度比值升高，腸道形態和吸收功能得到改善。PAS染色顯示，該組腸道中成熟的杯狀細胞數量顯著增多，有助于黏液分泌和黏膜屏障保護。
體內成像與腸道sIgA表達分析
活體熒光成像結果表明，與鋁佐劑組相比，PEI-LSP-RA-PLGA/Cy5.5在注射后8小時即擴散至腹腔，并在腺胃和腸道出現強熒光信號，且在12天內持續顯示腸道靶向性，證實其具有優異的緩釋和腸道靶向能力。免疫熒光分析顯示，PEI-LSP-RA-PLGA/H9N2組雛雞腸道中分泌型IgA(sIgA)陽性細胞數量顯著增加，腸道免疫功能得到增強。
轉錄組測序分析
轉錄組測序發現，PEI-LSP-RA-PLGA/H9N2處理引起了大量基因的差異表達。京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析顯示，Toll樣受體(TLR)通路、NOD樣受體(NLR)通路以及“腸道IgA產生免疫網絡”通路被顯著激活。基因本體(GO)分析表明，CC趨化因子受體(CCR)信號通路、CCR6信號通路和白細胞介素-17(IL-17)細胞因子信號通路表達上調。這些通路與免疫細胞激活、遷移、歸巢及黏膜免疫密切相關。
腸道mRNA與免疫組織化學驗證
qPCR和IHC結果進一步證實了上述機制。PEI-LSP-RA-PLGA/H9N2組雛雞腸道中CCR9、CCL25、CCR6、CCL20以及IL-17、IL-15、IL-4的mRNA和蛋白表達水平均顯著上調。這表明該納米佐劑通過上調CCR9/CCL25和CCR6/CCL20這對“歸巢受體-配體”，引導免疫細胞向腸道黏膜遷移和歸巢，從而實現腸道靶向；并通過調節IL-17、IL-15和IL-4等細胞因子，激發強烈的腸道免疫反應。
研究結論與意義
綜上所述，本研究成功開發了一種名為PEI-LSP-RA-PLGA的新型多免疫調節納米佐劑。該佐劑作為H9N2疫苗的佐劑，在肌肉注射后能在淋巴結引發強烈的全身免疫反應，同時通過血液循環實現腸道歸巢，并在腸道內誘發出有效的黏膜免疫應答，從而提供持久而強大的免疫保護。其作用機制在于：通過負載的RA誘導免疫細胞表達腸道歸巢受體CCR9和CCR6，在相應趨化因子CCL25和CCL20的梯度引導下靶向腸道；隨后，通過TLR通路、NLR通路激活固有免疫，并通過“腸道IgA產生免疫網絡”等途徑，協同負載的LSP的免疫增強作用，最終顯著提升全身IgG和黏膜IgA水平，改善腸道健康，全面增強機體防御能力。
這項研究的重大意義在于，它提供了一種能夠同時激發強大全身免疫和黏膜免疫的多功能疫苗佐劑新策略，有望突破現有H9N2等黏膜感染病原疫苗的效力瓶頸。盡管該佐劑目前以乳液形式存在，長期儲存和運輸面臨挑戰，但其展現出的卓越性能為未來開發新型、高效的獸用及人用疫苗佐劑指明了富有潛力的方向。
