《Poultry Science》：Virulence attenuation of intestinal pathogenicity via combined gene deletion in duck enteritis vaccine strain restores gut microbiota balance and enhances safety
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為應對大規模禽類養殖中傳染病防控對安全高效疫苗的需求，研究人員通過基因編輯技術構建了多基因缺失的鴨腸炎病毒減毒株ΔTK-ΔgI/gE-ΔgG/gJ。該研究首次系統評估了該疫苗株對多種動物模型（鴨子、SPF雛雞、小鼠等）腸道菌群的影響，發現其不僅安全性顯著優于親本株，還能有效恢復因免疫而失衡的腸道菌群結構。該結果為通過靶向編輯減毒以提升疫苗安全性提供了新的理論和實踐依據。
在全球大規模家禽養殖的背景下，傳染病的爆發常常造成巨大的經濟損失。鴨腸炎病毒（Duck Enteritis Virus, DEV），又稱鴨瘟病毒，是皰疹病毒家族的一員，嚴重危害水禽養殖業。傳統的疫苗雖然在防控中起到關鍵作用，但其安全性，特別是對動物腸道健康的影響，一直是個被忽視的“黑箱”。腸道菌群被稱為動物的“第二大腦”，其平衡與宿主的免疫功能和整體健康息息相關。那么，注射疫苗是否會像病原體感染一樣，擾亂這道重要的健康防線呢？為了回答這個問題，并開發出更安全的新一代疫苗，研究團隊將目光投向了基因編輯技術。
研究人員創新性地將基因“剪刀”對準了DEV的多個毒力基因。他們認為，通過精準刪除這些基因，或許能在保留病毒免疫原性的同時，大大降低其致病性，并且可能減輕對腸道環境的干擾。他們的研究成果《Virulence attenuation of intestinal pathogenicity via combined gene deletion in duck enteritis vaccine strain restores gut microbiota balance and enhances safety》發表在《Poultry Science》期刊上，為我們揭開了疫苗、基因減毒與腸道菌群之間錯綜復雜的關系。
為了開展這項研究，研究人員主要運用了以下幾項關鍵技術方法：首先，利用細菌人工染色體（BAC）克隆技術與Red/ET同源重組技術，成功構建并拯救了同時缺失胸苷激酶（TK）、糖蛋白I/E（gI/gE）及糖蛋白G/J（gG/gJ）基因的重組DEV減毒株（BAC-DEV-ΔTK-ΔgI/gE-ΔgG/gJ）。其次，研究在多種動物模型（包括SPF鴨胚、一日齡SPF雛雞、四周齡BALB/c小鼠、以及鴨、鴿、鵝、白腰文鳥、鵪鶉等）中系統評估了該減毒株的體內安全性和病毒復制動力學。最后，通過采集免疫后動物的腸道內容物樣本，利用針對細菌16S rRNA基因V3-V4區的Illumina NovaSeq高通量測序平臺進行測序，并借助QIIME2等生物信息學工具，深入分析了腸道微生物群落的組成、多樣性和結構變化。
研究結果部分如下：
Generation and identification of BAC-DEV-ΔTK-ΔgI/gE-ΔgG/gJ
研究團隊成功構建了五基因缺失的DEV減毒株。體外實驗表明，該缺失株在鴨胚成纖維細胞中的復制動力學與親本株相似，但病毒滴度峰值略低，證明了其毒力減弱的同時保留了良好的復制能力。
Clinical signs following inoculation of the gene deletion strain
動物安全性實驗給出了令人矚目的結果。親本株對一日齡SPF雛雞和白腰文鳥具有高度致病性，接種后出現了嗜睡、綠色糞便等癥狀，并導致100%的死亡。與之形成鮮明對比的是，接種基因缺失株的所有動物（包括上述易感物種）在14天的觀察期內均未出現臨床癥狀或死亡，證明了其卓越的安全性。
Virus replication levels of the gene deletion strain in the intestinal tract
通過實時定量PCR檢測，發現在鴨子、SPF雛雞、鵝、鵪鶉和白腰文鳥的腸道中，基因缺失株和親本株在免疫后第4天均能檢測到病毒復制，但缺失株的病毒載量普遍低于親本株。而在鴿子和小鼠的腸道中未檢測到DEV復制，表明病毒宿主范圍存在限制。
Safety of clinical observation
病理學觀察進一步印證了安全性差異。接種親本株的SPF雛雞和白腰文鳥腸道出現明顯的黏膜充血、出血、絨毛斷裂和上皮細胞脫落等嚴重病變。而接種基因缺失株的動物，其腸道組織形態與陰性對照組相似，未觀察到顯著病理變化。
The microbiota composition is altered following intestinal infection in ducks
通過對鴨子腸道菌群的深入分析，發現免疫顯著改變了菌群組成。在門（Phylum）水平，接種后厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度增加，而變形菌門（Proteobacteria）豐度下降，親本株組中變形菌門甚至幾乎檢測不到。在屬（Genus）水平，Candidatus Arthromitus等菌屬特異性富集。
DEV induced variations in the diversity and richness of intestinal microbiota in ducks
α多樣性分析（如Shannon指數）顯示，接種親本株顯著降低了鴨子腸道菌群的物種多樣性。而接種基因缺失株的組別，其菌群多樣性得到了顯著恢復，物種豐富度更高。β多樣性分析（如PCoA、NMDS）也表明，不同處理組的腸道菌群結構存在明顯分離。
Overall microbiota distribution and abundance in SPF chicks
在SPF雛雞中觀察到了類似的菌群擾動模式。親本株免疫導致了變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度異常升高。而基因缺失株免疫后，這一變化得到部分逆轉，同時乳桿菌科（Lactobacillaceae）的豐度得以維持。
Variations in the diversity and richness of intestinal microbiota induced by DEV in SPF chicks
與鴨子結果一致，接種親本株降低了雛雞腸道菌群的多樣性（Shannon指數最低）。而接種基因缺失株的組別，其腸道菌群多樣性最高，表明缺失株能在引發免疫反應的同時，更好地維持腸道微生態的穩定。
The microbiota of the intestines is altered after infection in mice
盡管DEV在小鼠腸道中不復制，但免疫依然影響了其菌群。親本株免疫導致小鼠腸道菌群總體豐度降低，尤其是擬桿菌門（Bacteroidota）幾乎檢測不到。基因缺失株免疫則能更好地維持菌群穩態，例如毛螺菌科（Lachnospiraceae）的豐度有所增加。
Alterations in the diversity and richness of the intestinal microbiota induced by DEV in mice
多樣性分析顯示，基因缺失株免疫組的小鼠腸道菌群擁有最高的Shannon指數（多樣性）和Chao1指數（豐富度），顯著高于親本株組和對照組，表明該疫苗株對非靶動物模型腸道菌群有積極的調節作用。
在討論與結論部分，本研究首次報道了通過多基因聯合缺失策略成功構建的DEV減毒疫苗株，并首次在靶動物和非靶動物中系統評估了疫苗免疫對腸道菌群的體內影響。研究表明，傳統的DEV親本疫苗株會破壞腸道形態并引起菌群失調，而新構建的基因缺失株（BAC-DEV-ΔTK-ΔgI/gE-ΔgG/gJ）不僅安全性顯著提高（在低日齡易感動物中不致病、不致死），還能在很大程度上恢復和維持腸道菌群的多樣性與平衡。這種對腸道微生態的“友好”特性，可能是其安全性提升的重要機制之一。該研究將疫苗研發的焦點從單一的免疫保護效力，擴展到了對宿主整體健康尤其是腸道健康的影響評估，為開發新一代“生態友好型”安全疫苗提供了全新的視角和可行的技術路徑。研究也指出，未來需要更大樣本量和更長期的觀察來進一步豐富和驗證這些發現。總之，這項研究標志著通過基因編輯減毒來優化疫苗安全性策略邁出了重要一步，對保障養殖業健康發展和動物福利具有重要的理論和實踐意義。
