《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Split Technology in CRISPR-Cas System for Precision Genome Manipulation and Diagnostics
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split CRISPR-Cas系統通過模塊化分割Cas蛋白或核酸組分實現可控組裝，解決傳統系統的脫靶效應、遞送限制及檢測靈敏度問題，在精準基因編輯和生物傳感中展現潛力。
高雅卿|云陽芳|張晶晶
中國南京大學化學與生物醫學創新中心（ChemBIC）化學學院，生命科學分析化學國家重點實驗室，南京210023
摘要
CRISPR-Cas系統從根本上改變了基因組編輯和分子診斷領域，但其潛力受到應用特定限制的制約——即在治療效果編輯中存在脫靶效應和遞送難題，在診斷和生物成像應用中則存在靈敏度不足、背景干擾高以及目標范圍狹窄等問題。為此，研究人員開發了分裂型CRISPR-Cas技術，該技術將核心功能組件（如Cas蛋白或sgRNA）設計成兩個或多個無活性的片段。這些模塊只有在預定義條件下才能重新組裝成活性復合體，從而實現對編輯和檢測事件的高精度時空控制。本文系統總結了主要的分裂策略，包括基于蛋白質和核酸的分割方法，并詳細闡述了它們的激活機制。此外，我們還重點介紹了分裂型CRISPR-Cas系統在提高診斷特異性和可編程性方面的新興應用。最后，討論了關鍵技術挑戰，并展望了下一代分裂系統的開發方向。
引言
CRISPR（成簇規律間隔短回文重復序列）及其相關Cas蛋白最初在大腸桿菌基因組中被發現，這一發現徹底改變了基因工程領域[1]、[2]。該系統最初被描述為細菌和古菌的一種適應性免疫機制，它利用CRISPR衍生的RNA（crRNA）引導Cas核酸酶識別并切割入侵病毒DNA中的特定序列[3]、[4]。其核心組成部分包括：（1）Cas蛋白，負責執行靶向雙鏈DNA切割[5]；（2）引導RNA（gRNA），通過20個核苷酸的間隔區賦予序列特異性，并與Cas蛋白形成復合體[6]；（3）短前間隔序列（PAM），對識別和切割啟動至關重要[7]、[8]。這一可編程機制的闡明為其在真核細胞中的多功能基因組編輯應用奠定了基礎[9]、[10]、[11]、[12]。
這一突破促進了具有不同特性的Cas蛋白簇的發現和開發，例如Cas12a和Cas13，它們在目標特異性（DNA vs. RNA）和切割活性方面存在差異[13]、[14]、[15]。CRISPR的基本基因切割能力迅速擴展為了一套復雜的工具，涵蓋了堿基編輯[16]、[17]、啟動子編輯[18]、轉錄激活/抑制（CRISPRa/i）[19]、表觀遺傳修飾[20]以及高級診斷平臺（如SHERLOCK）[21]。CRISPR技術的革命性影響得到了國際認可，Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna因此獲得了2020年諾貝爾化學獎。
盡管CRISPR-Cas平臺具有巨大潛力，但其精確度和適用性仍受到若干限制的制約，包括脫靶效應、持續的核酸酶活性、缺乏精確的時間控制以及多重編輯能力方面的挑戰[18]、[22]。此外，載體的攜帶能力有限也影響了遞送效率。例如，常用的腺相關病毒（AAV）的最大載量僅為4.7 kb，而像化膿性鏈球菌Cas9（SpCas9）這樣的核酸酶體積較大（約4.2 kb），進一步增加了病毒遞送的難度。在分子診斷和生物成像領域，性能通常受到其他因素的限制：未擴增檢測的靈敏度受Cas酶動力學影響；目標范圍主要局限于核酸；高保真度細胞成像受到信噪比低和背景干擾的挑戰[23]。這些挑戰推動了更可控、更安全的CRISPR平臺的發展。
為克服這些限制，分裂型CRISPR-Cas系統作為一種創新的工程策略應運而生。該方法將關鍵組件（如Cas蛋白或核酸成分）分割成兩個或多個無活性片段，只有在一個特定觸發條件下才能重新組裝成功能性復合體（圖1）。這種設計實現了精確的時空控制，顯著縮小了核酸酶活性的時間窗口和空間范圍，從而提高了特異性并減少了脫靶效應和潛在毒性。分裂系統的模塊化架構還便于實現布爾邏輯運算（例如AND門），進一步提升了復雜基因組干預的可編程性[14]。本文系統概述了分裂型CRISPR-Cas系統的主要設計策略和激活機制，強調了它們在生物傳感和治療領域的廣泛應用，并討論了該領域未來的發展方向。
CRISPR-Cas系統中的分割策略
“分裂”系統的基本概念是將一個功能性生物實體合理分割成兩個或多個無活性模塊。這些模塊僅在暴露于特定觸發因子時才能重新組裝成活性復合體，從而恢復所需的功能。在CRISPR-Cas技術中，這一策略主要通過兩種正交方法實現：分割Cas蛋白本身或分割其核酸引導成分。
Intein介導的剪接
Intein是一種自我剪接的蛋白質元件，能夠在翻譯后切除自身并將兩側的extein序列連接起來形成成熟的、具有功能的蛋白質[52]、[53]。在分裂型CRISPR系統中，Cas蛋白被分割成N端和C端片段，每個片段分別與一個intein的相應部分融合[54]。共同表達時，intein片段介導精確的蛋白質跨剪接，重新組裝成完整的、有活性的Cas核酸酶。這一策略已被證明非常有效分裂型CRISPR-Cas系統的應用
分裂型CRISPR-Cas技術在分析和治療領域展示了顯著的應用潛力，這得益于其高度可控性、低背景信號和優異的適應性。功能組件的條件性重組實現了精確的時空調控，克服了傳統CRISPR工具的脫靶效應、持續活性和遞送限制等關鍵問題。以下部分總結了其主要應用分裂型CRISPR-Cas技術的主要挑戰和未來發展方向
分裂型CRISPR-Cas技術在特異性、遞送和時空控制方面具有顯著優勢，但其實際應用仍面臨一些挑戰。本節概述了主要挑戰及可能的解決策略（表2）：結論
分裂型CRISPR-Cas技術是對傳統CRISPR工具的重大改進，直接解決了長期以來在特異性、可控性和遞送性方面的局限。通過將Cas蛋白或核酸引導成分分割成條件性重組的模塊，該平臺實現了對基因組編輯和分子檢測的精確時空控制。多種分割策略（包括Intein介導的剪接、化學或光誘導的二聚化等）進一步增強了其應用潛力
CRediT作者貢獻聲明
張晶晶：撰寫——審稿與編輯、監督、資源管理、項目協調、資金獲取、概念構思。云陽芳：撰寫——審稿與編輯、初稿撰寫、方法學設計、數據分析、概念構思。高雅卿：初稿撰寫、可視化處理、方法學設計、概念構思
競爭利益聲明
? 作者聲明沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本研究得到了中國國家重點研發計劃（2025YFC3409100）、江蘇省自然科學基金（編號BK20242022）、國家自然科學基金（編號22574075）以及生命科學分析化學國家重點實驗室（編號5431ZZXM2505）的支持。作者還感謝BioRender和PyMOL在提供圖形元素方面的幫助。
