非洲豬瘟病毒（ASFV）是導致非洲豬瘟（ASF）的病原體，該病是家豬和野豬的一種高度傳染性和破壞性的出血性病毒性疾病，對全球養豬業構成嚴重威脅。目前尚無有效的疫苗或治療方法。ASFV的形態發生過程極其復雜且機制尚未完全闡明。本文聚焦于ASFV的內膜蛋白pH108R，探討其在病毒粒子形態發生中的作用。

ASFV蛋白pH108R之前被鑒定為一種病毒內膜蛋白，在病毒復制周期晚期表達。其氨基酸序列在不同ASFV毒株間高度保守，含有一個假定的跨膜結構域。通過免疫熒光和蛋白質印跡實驗證實，在感染ASFV GS株的豬肺泡巨噬細胞（PAMs）中，pH108R信號主要位于核周的病毒工廠區域，與病毒內膜蛋白p54共定位。其轉錄和蛋白表達動力學分析顯示，H108R基因與B646L基因表現出相似的轉錄動力學，且其蛋白（約12-kDa）在感染后12小時可被檢測到，晚于衣殼蛋白p72的表達。進一步的膜拓撲學分析表明，與跨膜病毒蛋白pE248R類似，pH108R主要存在于膜組分中，并且能夠耐受堿性碳酸鹽處理，在Triton X-114誘導的溫度相分離中主要分配在去垢劑相中。這些結果綜合表明，ASFV蛋白pH108R是一種跨膜蛋白，在感染晚期表達并定位于病毒組裝位點。

為了研究pH108R蛋白在ASFV復制中的作用，研究人員利用同源重組技術，構建了缺失H108R基因的重組病毒ASFV-GS-ΔH108R，該病毒在p72啟動子控制下表達綠色熒光蛋白（EGFP）作為報告基因。經過多輪純化與鑒定，證實pH108R表達在野生型病毒感染的細胞中被檢測到，而在重組病毒感染的細胞中幾乎無法檢測。生長曲線實驗顯示，無論在一步還是多步生長曲線中，與親本病毒ASFV-GS相比，缺失pH108R都會導致病毒產量降低超過1個對數值。這表明H108R的缺失顯著抑制了ASFV-GS在體外的復制能力。

接下來，研究團隊通過透射電子顯微鏡（EM）觀察了pH108R缺失對病毒形態發生的影響。在感染親本病毒ASFV-GS 18和36小時后，病毒工廠內可檢測到前體病毒膜以及未成熟和成熟的病毒粒子。然而，在缺失pH108R表達的細胞中，組裝位點出現了大量異常的管狀結構和雙葉狀結構，而成熟粒子的數量則顯著減少。定量分析顯示，在pH108R缺失的情況下，病毒工廠中異常管狀結構和雙葉狀結構的比例大幅增加，而成熟病毒粒子的比例則急劇下降。即使在感染36小時后，這種現象依然存在，并且成熟粒子比例低于27%。同時，與親本病毒相比，ASFV-GS-ΔH108R的病毒滴度在18和36小時均下降了約1.5至1.8個對數值。將異常粒子的比例歸一化到病毒滴度后，發現缺失pH108R條件下產生的異常顆粒比例分別是存在pH108R條件下的13倍（18小時）和50倍（36小時）。這些結果表明，蛋白pH108R參與了病毒的形態發生過程。

為了探究缺失pH108R影響病毒形態發生的機制，研究人員檢測了位于病毒五個結構域的主要結構蛋白的表達水平。結果表明，在感染早期（18小時），pH108R的缺失顯著降低了衣殼蛋白（p72和p49）、內膜蛋白（p54和pE248R）、核心殼蛋白（pp220、pp62和pS273R）以及核樣蛋白（p10和pA104R）的水平，而早期表達蛋白p30的表達則未受到顯著影響。病毒基因組復制分析顯示，H108R缺失在感染后12、18和24小時顯著降低了病毒的基因組復制。這表明pH108R的缺失可能在感染早期通過抑制病毒基因組復制，進而抑制了晚期蛋白的表達，從而損害病毒形態發生。

有趣的是，在感染晚期（36和48小時），衣殼蛋白、內膜蛋白、核心殼蛋白酶pS273R和核樣蛋白p10在缺失pH108R情況下的表達水平與存在pH108R時相似。然而，核心殼多蛋白pp220和pp62的蛋白酶解加工在缺失pH108R表達時受到損害，且這一現象并非由于病毒蛋白酶pS273R的減少所導致。此外，核樣蛋白pA104R在缺失pH108R時的表達水平也持續低于存在pH108R時。總之，這些發現表明，pH108R缺失在感染早期抑制病毒基因組復制從而抑制晚期蛋白表達，而在感染晚期則抑制核心殼多蛋白pp220和pp62的蛋白酶解加工以及核樣蛋白pA104R的表達。

由于ASFV-GS-ΔH108R病毒的表現型與之前報道的缺失p49蛋白（參與衣殼組裝過程）的ASFV重組體相似，研究人員進一步探究了衣殼蛋白是否存在于這些異常結構中。通過免疫金標記結合抗p72抗體，他們觀察到抗p72抗體標記了二十面體衣殼的最外層以及異常的管狀結構，這表明pH108R可能參與了衣殼的組裝。

鑒于缺失p49會產生類似的異常管狀結構，研究人員假設pH108R可能通過p49蛋白參與衣殼組裝。為驗證此假設，他們構建了帶有flag標簽的pH108R C末端片段和帶有myc標簽的p49 C末端片段，并通過免疫共沉淀（Co-IP）實驗證實，pH108R在HEK293T細胞和ASFV-GS感染的PAMs中均與p49蛋白存在相互作用。免疫熒光分析也顯示pH108R與p49在細胞中共定位。

有趣的是，在ASFV感染期間，p72蛋白也能與p49蛋白發生免疫共沉淀。進一步的Co-IP實驗表明，pH108R在HEK293T細胞和ASFV-GS感染的PAMs中同樣與p72蛋白存在相互作用，免疫熒光分析也證實了它們的共定位。這些發現共同證實了pH108R與衣殼蛋白p49和p72之間存在相互作用。

另一個值得關注的現象是，pH108R的缺失抑制了核樣蛋白pA104R的表達。為探究其機制，研究人員首先評估了ASFV-GS和ASFV-GS-ΔH108R感染的PAMs中pA104RmRNA的水平，結果表明pH108R缺失并未抑制pA104RmRNA的水平。隨后，在存在或缺失pH108R的條件下，通過添加蛋白質翻譯抑制劑放線菌酮（CHX）監測了pA104R的蛋白水平。結果顯示，缺失pH108R降低了pA104R的蛋白穩定性。此外，使用蛋白酶體、自噬和溶酶體抑制劑處理，均未能恢復因pH108R缺失導致的pA104R蛋白水平的降低。綜合來看，這些結果表明pH108R缺失引起的pA104R減少并非由轉錄或經典的翻譯后降解途徑造成。

鑒于pA104R已被證實參與病毒DNA復制和轉錄，研究人員探究了在感染早期觀察到的病毒晚期表達總體減少是否由pA104R水平的特異性降低引起。為此，他們構建了缺失A104R基因的重組病毒ASFV-GS-ΔA104R。病毒純化、PCR和測序分析確認了基因敲除的成功。

通過透射電鏡對PAMs在感染ASFV-GS或ASFV-GS-ΔA104R 18和36小時后的超微結構分析顯示，在野生型和敲除病毒感染的細胞中，細胞質病毒工廠的形態相似，均顯示出相似形態的病毒粒子，如前體病毒膜、未成熟和成熟粒子。此外，pA104R的缺失并不影響主要衣殼蛋白、內膜蛋白、核心殼蛋白、核樣蛋白以及早期表達蛋白p30的表達水平。同時，ASFV-GS-ΔA104R的復制能力與親本病毒相比僅略有下降。這些結果證明，pA104R的缺失并不影響ASFV的形態發生和蛋白表達。

為評估缺失H108R對ASFV-GS在豬體內致病過程的影響，研究人員對家豬進行了肌肉接種實驗。結果顯示，所有接種親本病毒ASFV-GS的豬在感染后第5天體溫升高（>40℃），并出現典型的非洲豬瘟臨床癥狀，所有豬在感染后第8天內死亡。相比之下，接種ASFV-GS-ΔH108R的8頭豬中，僅3頭出現短暫發熱，隨后體溫恢復正常，所有豬在21天的觀察期內均存活。接觸對照組豬的體溫保持穩定。

病毒載量分析表明，接種ASFV-GS的豬在口、鼻、糞便拭子以及血液和主要組織（脾、肺、腎、淋巴結）中均檢測到高水平的病毒DNA拷貝數。而接種ASFV-GS-ΔH108R的豬和接觸組豬的病毒載量則維持在極低或檢測不到的水平。此外，接種ASFV-GS的豬其脾、肺、腎和頜下淋巴結（SLN）出現廣泛出血病變，而接種ASFV-GS-ΔH108R的豬則無明顯病變。組織病理學切片也顯示，接種ASFV-GS的豬出現脾臟大面積出血、淋巴細胞壞死，淋巴結出血、淋巴細胞壞死和核碎裂，肺部間質性肺炎以及腎臟腎小管上皮細胞壞死等嚴重病理變化，而這些病理現象在接種ASFV-GS-ΔH108R的豬中則較為輕微。綜上所述，這些結果證實，從ASFV毒株中敲除pH108R會顯著減弱病毒對豬的致病力。

本研究發現，ASFV內膜蛋白pH108R在病毒形態發生中扮演著重要角色。缺失pH108R會導致大量管狀和雙葉狀異常結構的形成，這一表型與缺失衣殼組裝相關蛋白p49和pH240R的ASFV重組體相似。免疫金標記實驗證實這些異常結構含有衣殼蛋白p72，提示pH108R參與了衣殼組裝。進一步的互作研究顯示，pH108R與衣殼蛋白p49和p72均存在相互作用。鑒于p49與內膜結合的能力可能依賴于其與其他病毒膜蛋白的相互作用，pH108R與p49的互作為p49與內膜的關聯提供了證據。因此，pH108R可能通過與p49蛋白相互作用參與衣殼組裝。這一機制與其他病毒（如痘苗病毒、皰疹病毒）中通過病毒蛋白互作在病毒包膜和衣殼間建立橋梁的組裝過程類似。

此外，pH108R的缺失還抑制了核心殼多蛋白pp220和pp62的蛋白酶解加工，這可能是由于pH108R缺失阻礙了衣殼的正確組裝，進而影響了核心殼的組裝。另一方面，作為內膜蛋白，pH108R也可能直接參與內膜的形成，從而影響二十面體衣殼的組裝。

研究還發現，pH108R缺失會降低核樣蛋白pA104R的蛋白水平，但并非通過轉錄抑制或經典的蛋白酶體/溶酶體降解途徑。盡管有研究認為pA104R參與病毒晚期基因的轉錄調控且為病毒復制所必需，但本研究構建的pA104R缺失病毒并未影響ASFV的形態發生和蛋白表達，且異常結構的產生也并非由pA104R減少直接導致。因此，pH108R缺失可能通過影響病毒粒子對核樣成分的組裝，導致pA104R滯留在細胞質中，從而降低了其蛋白穩定性。

值得注意的是，pH108R缺失在感染早期也顯著抑制了病毒基因組的復制。其機制可能是pH108R直接參與了ASFV的基因組復制和修復過程，亦或是通過與參與該過程的其他蛋白或酶相互作用來發揮作用，具體機制有待進一步研究。

總之，本研究闡明了pH108R通過多種機制促進ASFV復制：一方面，通過與衣殼蛋白p49和p72相互作用參與ASFV的形態發生過程；另一方面，可能通過某種未知機制參與ASFV的基因組復制。這些發現為深入理解ASFV的形態發生機制提供了新的見解，并為開發減毒疫苗提供了一個有吸引力的潛在靶點。