顱頜面畸形，如下頜后縮和腭裂，是最常見且嚴重的先天性缺陷之一，常伴有骨骼發育缺陷和骨礦化不良。顱頜面骨發育依賴于間充質干細胞成骨分化的膜內成骨過程。近期證據凸顯了無定形磷酸鈣（ACP）前體在生物礦化中的作用，并揭示了一種涉及線粒體介導的細胞外礦化的替代機制。然而，這種由間充質干細胞驅動的細胞外礦化途徑是否促進顱頜面骨發育尚不清楚。

線粒體自噬由自噬受體介導，其中OPTN作為關鍵受體參與多種自噬過程。OPTN功能喪失與骨代謝紊亂密切相關，包括Paget骨病（PDB），而顱頜面受累是該疾病的一個公認特征。但OPTN在早期顱頜面發育中的具體作用仍未明確。機制上，OPTN功能喪失通過自噬非依賴途徑（如增強NF-κB激活）促進破骨細胞生成。另有證據表明，OPTN以自噬依賴的方式增強骨髓間充質干細胞的成骨分化。雖然OPTN因其在自噬中的多種作用而受到廣泛關注，但其在顱頜面發育過程中介導線粒體自噬的分子機制仍知之甚少。

液-液相分離（LLPS）最近被提出是細胞自組織的基本物理化學機制，能夠濃縮生物分子以促進各種生化過程。這一現象通常由兩種分子驅動力驅動：蛋白質中的內在無序區域（IDRs）和多價相互作用。越來越多的證據表明LLPS參與自噬的調控，提示其在組織自噬機制和介導貨物時空隔離中的作用。值得注意的是，經典的自噬受體如SQSTM1/p62通過與多聚泛素的多價相互作用經歷LLPS，形成胞質凝聚物。OPTN與SQSTM1具有顯著的結構和功能同源性，這表明OPTN可能在顱頜面骨發育過程中通過LLPS在線粒體自噬介導的ACP轉移中發揮潛在作用。

理解細胞內ACP轉移過程對于理解骨發育和病理性骨礦化的機制至關重要。我們的研究揭示了一個先前未被認識的機制，即OPTN LLPS協調線粒體自噬和ACP轉移，從而深刻影響骨礦化和顱頜面發育。這一過程受到兩種翻譯后修飾（PTMs）的精細調控：磷酸化和泛素化。

先前研究已確定，間充質干細胞中的線粒體自噬可由ACP的積累觸發，從而啟動ACP在細胞質細胞器間的運輸及其隨后的胞吐作用，進而促進骨形成和礦化。為確定線粒體自噬是否介導口頜面骨間充質干細胞（OMSCs）的骨礦化，我們在標準培養基和成骨分化培養基（ODM）中培養這些細胞，并通過透射電子顯微鏡（TEM）和定量實時PCR（qRT-PCR）評估線粒體自噬水平。結果揭示了在成骨分化過程中，線粒體自噬通量增加，電子致密顆粒的傳遞以及自噬相關基因（Map1lc3/Lc3、Becn1、Optn）表達上調。此外，堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅（ARS）染色表明，羰基氰氯苯腙（CCCP）誘導的線粒體自噬促進了成骨礦化，而巴弗洛霉素A₁（Baf-A1）抑制的線粒體自噬則減少了礦化。

OPTN是參與線粒體自噬的關鍵自噬受體，在骨骼發育和骨重塑中發揮重要作用。OPTN功能障礙與骨代謝紊亂（包括PDB）密切相關。鑒于在PDB患者中觀察到的顱頜面畸形，我們開發了optn基因敲除小鼠模型，以研究OPTN介導的線粒體自噬在顱頜面發育中的作用。出生后第21天（P21）的顯微CT分析顯示，這些小鼠的顱骨（頂骨、下頜骨和腭骨）礦化減少。出生后第1天（P1）的骨骼染色表明，optn^-/-小鼠的頂骨和頂間骨礦物質沉積減少，并伴有下頜后縮。鈣黃綠素雙標記進一步表明，OPTN的缺失顯著降低了礦物沉積率（MAR）、骨表面礦化面積（MS/BS）和骨形成率（BFR/BS），表明礦化活動受損。此外，通過馮庫薩、馬松三色和總膠原蛋白染色，在optn^-/-小鼠中觀察到更少的鈣沉積和新骨形成。

為了闡明潛在機制，我們在體內和體外評估了線粒體自噬和成骨活性。Mito-QC報告基因顯示optn^-/-小鼠的線粒體自噬通量大幅減少。OMSCs中的ALP和mtKeima測定證實，OPTN缺乏顯著損害了體外成骨潛能和線粒體自噬通量。在分子水平上，下頜切片的免疫組織化學（IHC）顯示成骨標志物（RUNX2、OPN、OCN）表達減少，而蛋白質印跡分析證實了在下頜組織和OMSCs中的類似減少。同時，IHC和蛋白質印跡分析都證明了線粒體自噬缺陷和異常的線粒體積累。

我們進一步檢查了礦化和線粒體自噬過程中OPTN的時空動力學。在未礦化狀態下，OPTN表現為細胞質點狀。在礦化誘導下，它聚集成球形液滴，ODM+CCCP組表現出更多更大的液滴。此外，在礦化誘導下，與吞噬泡（由LC3標記）或線粒體（由MitoTracker標記）共定位的OPTN液滴數量顯著增加，特別是在ODM+CCCP組中。這些觀察結果表明，OPTN可能在線粒體自噬和礦化過程中發生LLPS。

為了評估OPTN的相分離潛力，我們進行了生物信息學分析。MetaDisorder預測其NTD中存在具有低序列復雜度的IDRs。ProtParam顯示IDR富含帶電殘基，包括谷氨酸、賴氨酸和絲氨酸。PhaSePred進一步表明具有高相分離傾向。

我們通過在CCCP處理的293T細胞中表達EGFP-OPTN來研究OPTN斑點是否在線粒體自噬期間顯示液體樣特性。在此條件下，球形EGFP-OPTN液滴在細胞質中形成。熒光漂白后恢復（FRAP）測定顯示，漂白后90秒內熒光迅速恢復，表明與周圍細胞質的動態交換。使用光敏液滴測定，我們將OPTN與mCherry-Cry2融合，實現光誘導的蛋白質濃縮和液滴形成。Opto-OPTN形成動態簇，FRAP分析顯示熒光快速恢復。F?rster共振能量轉移（FRET）分析顯示，在CCCP誘導的線粒體自噬過程中，EGFP-OPTN和mCherry-OPTN之間的能量轉移隨時間增加。FRET效率的升高表明分子間距離減小和OPTN寡聚化增強，提示OPTN在線粒體自噬過程中發生顯著聚集。活細胞成像顯示，CCCP誘導導致小的OPTN液滴聚集成更大的液滴，在CCCP去除后這些液滴又重新分散。用1，6-己二醇（1，6HD）處理導致液滴溶解，但在1，6HD去除后它們重新形成。此外，FRAP實驗證明，OPTN在H₂O₂誘導的氧化應激條件下也表現出LLPS能力。這一發現意味著OPTN LLPS是對多種類型細胞壓力的響應機制。

我們隨后通過進行體外LLPS測定來驗證OPTN的LLPS特性。使用純化的重組EGFP-OPTN蛋白質在不同濃度的NaCl和蛋白質條件下觀察EGFP陽性液滴的形成和行為。OPTN的LLPS因低鹽和高蛋白質濃度而加速。添加擁擠劑PEG8000顯著增強了液滴形成。值得注意的是，FRAP證實了這些液滴的動態性質。這表明OPTN在體外表現出相分離能力，其相分離行為受NaCl濃度、蛋白質濃度和擁擠劑的影響。

為了闡明OPTN蛋白在礦化微環境中的作用，本研究將這些實驗發現擴展到OMSCs中進行驗證。在ODM中培養的optn敲除OMSCs中，轉染的EGFP-OPTN形成球形液滴，并在光漂白后表現出熒光恢復。這支持了OPTN液滴在OMSCs礦化過程中的液體樣性質，與報道的LLPS凝聚物的特征行為一致。這些發現表明OPTN在活細胞和體外均發生LLPS。

為了研究LLPS對線粒體自噬和成骨礦化的影響，LC3標記的吞噬泡與線粒體的熒光共定位以及ALP測定顯示，CCCP誘導的LLPS促進了線粒體自噬和礦化。相反，1，6HD對LLPS的抑制損害了這兩個過程。總之，這些證明了OPTN經歷LLPS來調控線粒體自噬和礦化。

我們分析了OPTN的結構域，以確定負責LLPS的關鍵結構域。OPTN的NTD包含一個IDR，如PONDR數據庫所預測。CTD含有一個參與線粒體自噬的泛素結合結構域（UBD）。

因此，我們構建并轉染了兩個截短片段：mCherry標記的OPTN-NTD和OPTN-CTD到293T細胞中，以檢查它們的LLPS特性。在CCCP誘導下，OPTN-NTD和OPTN-CTD都在轉染的細胞中形成許多球形液滴，這些液滴在FRAP測定中表現出熒光恢復。值得注意的是，OPTN-CTD顯示出更強的相分離傾向，表現為更高比例的液滴形成細胞和更高的熒光恢復率。FRAP分析進一步證實，NTD和CTD液滴在氧化應激條件下保留了LLPS能力。此外，活細胞成像證明，NTD和CTD衍生的液滴都能夠發生融合事件，突出了它們的液體樣行為。

隨后，EGFP標記的OPTN-NTD和OPTN-CTD被純化，并在不同蛋白質和NaCl濃度下進行體外液滴形成測定，模擬全長OPTN的條件。兩個截短片段都表現出形成液體液滴的能力。添加10% PEG8000誘導了液體液滴向聚集體的轉變。這些結果強調了NTD和CTD在OPTN LLPS中的重要作用。小鼠OPTN的NTD和CTD在OMSCs礦化過程中的相分離能力也通過FRAP實驗得到證實。因此，由OPTN蛋白的NTD和CTD驅動的相分離可能在礦化微環境中起關鍵作用。

為了識別CCCP誘導的線粒體自噬過程中OPTN凝聚物的組成，我們在轉染了TurboID-mCherry-OPTN的293T細胞中使用了生物素鄰近標記和質譜分析。通過比較對照組和CCCP處理組的質譜數據，我們確定了在CCCP誘導條件下OPTN蛋白質凝聚物中特異性富集的蛋白質。總共檢測到1440種蛋白質，其中991種與線粒體自噬相關。進一步的篩選揭示了24種差異表達蛋白質，它們與OPTN蛋白的相互作用在CCCP處理后發生了顯著變化。將這些結果與已知的線粒體自噬相關蛋白質進行交叉比對，突出了可靠的OPTN伴侶。在鑒定的蛋白質中，STK4因其與線粒體自噬的高度相關性而被選中。STK4先前已被報道通過調節磷酸化事件來增強線粒體自噬。然而，其與OPTN的相互作用尚不清楚。使用免疫熒光染色和免疫共沉淀測定，本研究證實STK4在細胞質中與OPTN蛋白共定位并直接相互作用。用STK4抑制劑XMU-MP-1處理顯著降低了OPTN絲氨酸殘基的磷酸化水平。FRAP分析進一步表明，XMU處理抑制了OPTN的流動性。免疫熒光和ALP測定表明，XMU顯著抑制OMSCs的線粒體自噬和成骨能力。

我們通過磷酸化質譜進一步鑒定了STK4在OPTN上的特異性磷酸化位點，確定絲氨酸173為關鍵磷酸化位點。鑒于S173位于NTD，我們假設STK4通過此位點促進OPTN-NTD相分離。為了驗證這一點，我們構建了OPTN-NTD-S173A突變體以防止S173的磷酸化，并將其與野生型OPTN-NTD一起在OPTN敲除的293T細胞中表達。S173A突變和XMU處理均導致磷酸化水平降低。FRAP分析顯示，S173A突變損害了OPTN-NTD相分離。此外，OPTN-NTD和OPTN-NTD-S173A突變體在XMU處理后無法形成相分離的液滴。用λ蛋白磷酸酶處理也顯著抑制了OPTN-NTD和OPTN-FL的LLPS，表明磷酸化促進了OPTN相分離。這些結果表明，STK4通過特異性磷酸化其NTD內的S173來觸發OPTN相分離。

OPTN-CTD區域包含一個與多聚泛素鏈特異性相互作用的UBD。由于具有多價串聯結構域的多聚泛素鏈驅動LLPS，我們假設這些多價相互作用增強了OPTN LLPS并支持線粒體自噬。為了驗證，我們將EGFP-Ub與各種OPTN片段（包括OPTN-FL、OPTN-CTD、OPTN-NTD、OPTN-CTD-D474N）共轉染到OPTN KO 293T細胞中。泛素增強了OPTN-FL和OPTN-CTD中OPTN液滴的流動性，表現為更高的熒光恢復率。在OPTN-CTD-D474N中，泛素部分共定位，可能是由于UBD功能不完全。未共定位的OPTN-CTD-D474N液滴在漂白后沒有恢復。在OPTN-NTD組中，液滴的80秒熒光恢復率不受泛素添加的影響。為了進一步研究泛素對OPTN體外LLPS的影響，我們將EGFP-OPTN-FL與純化的mCherry標記的線性泛素鏈在不同濃度下孵育。更高的泛素鏈水平顯著促進了LLPS液滴的形成。使用此濃度，我們觀察到泛素鏈強烈促進了EGFP-OPTN-FL和EGFP-OPTN-CTD的LLPS，但對EGFP-OPTN-NTD或突變體EGFP-OPTN-CTD-D474N則沒有。這些結果表明，泛素化通過CTD介導的多價相互作用促進OPTN LLPS。

值得注意的是，延時成像直接捕捉到了OPTN LLPS液滴在線粒體上動態招募吞噬泡的實時動態過程。這為OPTN凝聚物與線粒體吞噬泡形成的共存提供了直接的視覺證據。鑒于OPTN包含一個具有LC3-II結合LIR基序的NTD和一個能夠結合泛素的CTD——這兩者對于線粒體自噬都是必需的，我們試圖剖析由這些結構域介導的LLPS對自噬過程的貢獻。為此，我們將EGFP-Ub或EGFP-LC3與不同mCherry標記的人OPTN構建體共轉染到OPTN KO 293T細胞中。

我們首先通過檢查OPTN凝聚物與EGFP-Ub的重疊來評估泛素結合。OPTN-FL和OPTN-CTD與EGFP-Ub完全共定位，而OPTN-CTD-D474N僅顯示部分重疊，OPTN-NTD和OPTN-NTD-S173A則沒有。這些結果表明，CTD介導的LLPS對于線粒體自噬過程中UBD依賴的泛素識別至關重要，其中D474殘基起關鍵作用。我們接下來分析了線粒體關聯。OPTN-FL和OPTN-CTD與線粒體強烈共定位，這與它們的泛素識別模式一致，而OPTN-CTD-D474N顯示出受損的重疊。OPTN-NTD和OPTN-NTD-S173A均不與線粒體關聯。

為了評估吞噬泡的參與，我們評估了與LC3的重疊。OPTN-FL和OPTN-NTD液滴與EGFP-LC3強烈關聯，但這種相互作用在NTD-S173A突變體中被破壞。OPTN-CTD與LC3有中等程度的重疊，這在D474N突變體中幾乎被消除。這些結果表明，由S173調控的NTD驅動的LLPS促進了LC3簇集和吞噬泡組裝，而CTD殘基D474通過穩定凝聚物間接支持了這一過程。最后，我們通過評估溶酶體關聯來檢查自噬清除。OPTN-FL與溶酶體強烈共定位，而NTD-S173A和CTD-D474N突變體則沒有。單獨的OPTN-NTD和OPTN-CTD顯示部分重疊，表明存在殘留的自噬通量。總之，線粒體自噬測定表明，由CTD-D474泛素化介導的LLPS能夠實現貨物識別，而由NTD-S173磷酸化調控的LLPS則驅動LC3依賴的吞噬泡成熟，從而協調高效的自噬體-溶酶體融合和清除。

為了測試這些機制是否通過線粒體自噬調控成骨礦化，我們將EGFP標記的小鼠OPTN構建體轉染到OPTN缺陷的OMSCs中。ALP和ARS測定顯示，與全長構建體相比，NTD和CTD的礦化減少，而NTD-S183A和CTD-D477N突變體的礦化減少更甚。總之，這些發現確定，由NTD-S183磷酸化和CTD-D477泛素化介導的LLPS促進了OMSCs中的成骨礦化。

我們進一步研究了OPTN LLPS調控礦化的信號通路和分子機制。將CCCP誘導的OPTN鄰近相互作用組數據與OPTN缺陷干細胞在礦化條件下的轉錄組數據整合，確定了SLC6A15是唯一一個顯著富集且發生轉錄改變的基因。SLC6A15編碼一個中性氨基酸轉運蛋白，提示其在礦化過程中的代謝調節作用。此外，KEGG通路富集分析顯示，OPTN敲低后鈣信號通路顯著富集。這一轉錄譜表明，OPTN的缺失擾亂了成骨礦化所必需的代謝穩態和鈣轉運。

OPTN在脊椎動物中高度保守。利用能夠進行實時成像和基因操作的斑馬魚模型，我們在體內驗證了Optn LLPS在骨礦化和發育中的作用。在發育階段，Optn蛋白在斑馬魚頭部形成液滴。FRAP數據表明Optn發生LLPS。我們觀察到，在用二甲氧基甘氨酸（DMOG，一種在斑馬魚中已驗證的線粒體自噬誘導劑）誘導線粒體自噬后，斑馬魚中Optn液滴的數量及其與LysoTracker的共定位增加。相反，添加1，6HD抑制了這種現象。在120小時后，顱頜面軟骨的阿利新藍染色顯示中堿性區與酸性區（B:A）的比率降低，提示DMOG+1，6HD組存在下頜后縮。受精后第10天的鈣黃綠素染色表明，DMOG的應用促進了斑馬魚的礦化和鈣沉積。相比之下，DMOG+1，6HD組的骨礦化受到抑制。

為了進一步研究optn介導的線粒體自噬對斑馬魚礦化的影響，我們通過注射靶向optn的反義嗎啉寡核苷酸創建了optn敲低斑馬魚胚胎。optn MO顯著增加了斑馬魚的畸形率，并誘導了幼蟲的下頜后縮。

隨后，本研究采用轉基因自噬報告斑馬魚系進一步評估optn敲除對自噬的影響。在該系統中，EGFP-mCherry雙熒光系統用于標記LC3蛋白。結果顯示，在optn MO轉基因斑馬魚組中，黃色和紅色信號減弱，表明自噬通量降低。map1lc3b的mRNA水平也證實了這些發現。此外，ARS和鈣黃綠素染色表明optn MO組斑馬魚的鈣沉積較少。成骨標志物mRNA水平的降低進一步支持了這一結論。

我們前面的部分已經表明，S173介導的磷酸化和D474N介導的泛素化是影響Optn相分離的關鍵因素。由于這些殘基在人類和斑馬魚之間是保守的，我們進一步研究了等效殘基S140和D411在斑馬魚骨礦化和發育中的作用。我們將optn FL mRNA、optn S140A mRNA和optn D411N mRNA注射到optn敲低斑馬魚中。注射構建體的斑馬魚畸形率顯著高于對照組。qRT-PCR實驗表明，optn FL mRNA有效挽救了因optn敲低導致的線粒體自噬和成骨缺陷，而optn S140A和D411N mRNA僅提供了減弱的挽救。我們使用轉基因斑馬魚來標記成骨細胞，并用ARS評估成骨分化和礦化。Optn敲低減少了sp7陽性成骨細胞面積和礦物質沉積，而optn FL mRNA在很大程度上恢復了這些缺陷，S140A和D411N mRNA僅提供了不完全的恢復。受精后第10天的鈣黃綠素染色和受精后第27天的顯微CT進一步證實了optn及其突變體對后期發育階段顱頜面骨礦化的影響。綜上所述，這些發現表明，由NTD磷酸化和CTD泛素化調控的OPTN LLPS是顱頜面骨發育中的一個保守機制。

顱頜面發育主要通過膜內成骨方式塑造，涉及骨髓間充質干細胞向成骨細胞和骨細胞分化的骨形成模式。最近的研究揭示了一種補充途徑，即間充質干細胞通過線粒體自噬介導的礦化促進骨形成，但它是否以及如何促進顱頜面骨發育仍然未知。在這里，我們證明OPTN是一種參與線粒體自噬的自噬受體，經歷LLPS，促進其NTD與吞噬泡以及其CTD與泛素鏈的相互作用。因此，OPTN作為一個樞紐，將受損的線粒體拴系到吞噬泡，使ACP能夠遞送到細胞外基質。此外，我們證實了S173或D474的突變會破壞凝聚物與吞噬泡或線粒體的共定位。通過使用基因敲除小鼠和斑馬魚模型，我們最終確定破壞OPTN驅動的LLPS和線粒體自噬會導致顱頜面礦化缺陷。

顱頜面發育異常包括形態學和礦化缺陷，嚴重損害面部美觀和功能。許多遺傳綜合征具有突出的顱頜面畸形，通常與異常的骨骼礦化相關。例如，由I型膠原蛋白基因突變引起的成骨不全癥，其特征是額部隆起和牙本質發育不全，伴有骨密度低和礦化不良。同樣，與PHEX基因突變相關的低磷性佝僂病，由于磷酸鹽代謝紊亂，表現為顱縫早閉和釉質發育不全。雖然先前的研究主要集中在顱頜面發育的基因突變和大體形態異常上，但控制礦化的分子機制在很大程度上仍然未知。在生物礦化過程中，我們的結果解決了一個長期存在的難題，即自噬受體如何協調如此多樣的信號，以準確地將受損線粒體連接到吞噬泡以實現ACP釋放。早期的研究表明，泛素鏈用“吃掉我”標簽標記受損的線粒體，該標簽被OPTN特異性識別，招募自噬效應物如LC3以啟動線粒體降解。最近的研究揭示了OPTN凝聚物在泛素化表面上的生物物理特性，其中液相形成通過毛細管力和潤濕效應增強了線粒體-吞噬泡相互作用。我們的研究強調，OPTN的泛素結合和LLPS都是吞噬泡形成和有效執行線粒體自噬的關鍵前提。

多價相互作用是LLPS的主要分子驅動力之一。在線粒體自噬的LLPS調控背景下，泛素鏈不僅充當降解信號，還扮演著額外的關鍵角色：它們的多價串聯結構促進了相分離凝聚物的形成。在這項研究中，泛素鏈顯著增強了OPTN相分離凝聚物的流動性。與其結構同源的蛋白質SQSTM1不同，OPTN能夠在體外自發進行LLPS，這種能力在存在泛素鏈的情況下進一步增強。值得注意的是，OPTN的UBD內的人D474N突變破壞了泛素鏈結合，導致相分離能力大幅下降。該突變與破骨細胞分化增加和PDB密切相關，這表明受損的相分離可能是某些骨骼發育障礙的關鍵分子機制。

IDR介導的多價性是蛋白質相分離的關鍵決定因素。截短實驗表明，缺乏CTD片段的OPTN-NTD仍然表現出熒光恢復。由于NTD包含廣泛的IDR片段，這表明除了泛素鏈介導的多價相互作用外，IDR本身可以獨立促進OPTN LLPS并有助于線粒體自噬的調控。這突顯了OPTN相分離受多價相互作用和IDR結構域的雙重影響。為了進一步闡明IDR介導的OPTN相分離的調控機制，本研究首次鑒定并驗證了絲氨酸/蘇氨酸激酶STK4作為OPTN相分離凝聚物的關鍵相互作用伙伴。經典理論描述，STK4主要通過磷酸化BNIP3來調節線粒體自噬，這是一種獨立于經典PINK1-PRKN/Parkin信號的途徑。然而，我們的研究揭示了一種新的調控模式：STK4通過磷酸化促進OPTN LLPS，從而以非經典方式間接調節PINK1-PRKN介導的線粒體自噬。磷酸化修飾向蛋白質引入負電荷，增強靜電相互作用并促進相分離。STK4特異性磷酸化OPTN的S173殘基，在N端的IDR區域引入負電荷。這種修飾增強了與帶正電的卷曲螺旋結構域的靜電相互作用，促進多聚體組裝，并最終驅動相分離過程。這一機制為理解線粒體自噬的復雜調控網絡提供了新的見解。

失調的相分離最近已成為由疾病相關突變或翻譯后修飾驅動的致病機制。在癌癥中，致癌突變利用異常的LLPS促進腫瘤發生，刺激了治療探索。然而，針對發育性骨骼疾病的類似策略仍然不發達。我們的研究通過識別OPTN相分離中的兩個關鍵調控位點：S173和D474，分別受磷酸化和泛素化調控，來填補這一空白。這兩個位點在人類、小鼠和斑馬魚中進化保守，強調了它們的功能重要性。D474先前已被認為與PDB相關，而S173是一個我們系統地驗證了其調控機制的新位點。功能測定表明，S173A和D474N突變損害礦化，建立了一個將基