心血管疾病是全球主要的死亡原因，而心肌缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷是缺血性事件及隨后的再灌注治療過程中常見的病理事件，會引發(fā)過度的氧化應(yīng)激、炎癥和心肌細(xì)胞凋亡。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）因其強大的自我更新、多向分化和免疫調(diào)節(jié)能力，在再生醫(yī)學(xué)中展現(xiàn)出潛力。然而，其臨床應(yīng)用受到植入效率低、滯留性差和移植后存活率降低等問題的限制。hUC-MSCs分泌的外泌體作為其旁分泌效應(yīng)的主要介質(zhì)，已成為一種有前景的細(xì)胞無創(chuàng)治療方法。這些納米級囊泡攜帶生物活性蛋白、脂質(zhì)和RNA，能夠調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能并促進組織修復(fù)。

芳香烴受體（AHR）是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，能感知內(nèi)源性和環(huán)境信號以調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。NLRP3炎癥小體是心肌H/R損傷期間炎癥和細(xì)胞焦亡的核心調(diào)節(jié)因子。本研究假設(shè)，源自AHR過表達(dá)hUC-MSCs的外泌體（AHR-exo）可通過調(diào)節(jié)AHR/NLRP3信號軸和促進抗炎免疫極化來減輕H/R誘導(dǎo)的心肌損傷。為了驗證這一假設(shè)，研究采用了體外心肌H/R模型，探討AHR-exo是否能減輕心肌細(xì)胞損傷，并深入研究了其如何調(diào)節(jié)心臟和免疫細(xì)胞中的AHR/NLRP3信號和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)。

研究使用了多種細(xì)胞系，包括hUC-MSCs、AC16人心肌細(xì)胞、THP-1單核細(xì)胞、人外周血樹突狀細(xì)胞（DCs）和T淋巴細(xì)胞。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在hUC-MSCs中過表達(dá)AHR，并通過siRNA敲低AHR。通過超速離心法從條件培養(yǎng)基中分離外泌體，并使用透射電子顯微鏡（TEM）和蛋白質(zhì)印跡法（檢測CD81陽性、Calnexin陰性）進行表征。

建立了多個細(xì)胞模型：AC16細(xì)胞經(jīng)歷6小時缺氧和24小時復(fù)氧以模擬H/R損傷；用PMA和LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為M1型巨噬細(xì)胞；構(gòu)建了樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)模型。采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗評估細(xì)胞毒性，流式細(xì)胞術(shù)（使用Annexin V-FITC/PI染色）分析細(xì)胞凋亡。通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）、蛋白質(zhì)印跡法和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）分別檢測mRNA、蛋白和細(xì)胞因子（如IL-1β、TNF-α、IL-18、IL-10、TGF-β）水平。使用流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞（CD86、CD80、CD163、CD206）、樹突狀細(xì)胞（CD40、MHCII、OX62、CD274/PD-L1）和T細(xì)胞（CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3）的表面標(biāo)志物和亞群。

與常氧對照組相比，H/R處理使AC16細(xì)胞活力下降約45.6%，而與hUC-MSCs共培養(yǎng)可使其恢復(fù)至對照水平的89.2%。同時，H/R使LDH釋放增加2.7倍，而在hUC-MSCs共培養(yǎng)組中降低了近55%。流式細(xì)胞術(shù)分析進一步顯示，H/R將細(xì)胞凋亡率從14.68%增加到44%，而hUC-MSCs共培養(yǎng)可將其顯著降低至30.74%。這些結(jié)果表明，hUC-MSCs通過恢復(fù)細(xì)胞活力、降低細(xì)胞毒性和抑制細(xì)胞凋亡，有效保護AC16細(xì)胞免受H/R損傷。

蛋白質(zhì)印跡和RT-qPCR結(jié)果顯示，H/R處理后心肌細(xì)胞中NLRP3、Bax、NF-κB和caspase-1的蛋白和mRNA水平顯著升高，而與hUC-MSCs共培養(yǎng)可使其顯著下調(diào)至接近基線水平。同時，AHR表達(dá)在H/R后增加了1.8倍，并在hUC-MSCs共培養(yǎng)后進一步增強至約2.6倍，其下游靶點CYP1A1和CYP1A2也隨之升高。ELISA證實，H/R顯著提高了IL-1β、TNF-α和IL-18的分泌，而hUC-MSCs使這些細(xì)胞因子水平降低了45-60%。此外，暴露于損傷AC16細(xì)胞的hUC-MSCs其AHR表達(dá)增加了約9倍，提示hUC-MSCs可能通過外泌體將上調(diào)的AHR轉(zhuǎn)移至AC16細(xì)胞。

為確認(rèn)AHR在hUC-MSCs介導(dǎo)的心肌保護中的作用，研究將AHR敲低（KD-AHR）的hUC-MSCs與H/R處理的AC16細(xì)胞共培養(yǎng)。CCK-8檢測顯示，KD-NC組細(xì)胞活力比H/R組提高了3.48倍，而KD-AHR hUC-MSCs未能恢復(fù)細(xì)胞活力，與H/R組無顯著差異。同樣，LDH釋放和凋亡率在KD-NC組顯著降低，但在KD-AHR組仍然很高。分子水平上，KD-AHR hUC-MSCs對NLRP3、AHR及其下游靶點的mRNA或蛋白水平無顯著影響，而KD-NC hUC-MSCs則顯著下調(diào)NLRP3并上調(diào)AHR。ELISA結(jié)果一致顯示，KD-NC共培養(yǎng)降低了IL-1β、TNF-α和IL-18濃度，而KD-AHR未能降低這些細(xì)胞因子水平。這些結(jié)果表明，AHR對于hUC-MSCs抵抗H/R損傷的抗炎和細(xì)胞保護作用是必不可少的。

通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得AHR過表達(dá)的hUC-MSCs，并分離其外泌體（AHR-exo）。TEM顯示外泌體典型的杯狀形態(tài)，蛋白質(zhì)印跡證實存在外泌體標(biāo)志物CD81且無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白Calnexin，表明外泌體制備成功且純度較高。RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析進一步證明，AHR-exo中AHR的mRNA（約8倍）和蛋白（約10倍）水平顯著高于對照組外泌體（NC-exo）。

用AHR-exo處理可顯著改善H/R損傷的AC16細(xì)胞活力，降低細(xì)胞毒性和凋亡率，而NC-exo則無顯著效果。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，AHR-exo下調(diào)了NLRP3、Bax、NF-κB和cleaved caspase-1的表達(dá)，同時顯著上調(diào)了AHR及其下游靶點CYP1A1和CYP1A2。ELISA進一步證實了促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-18水平的顯著降低。這些結(jié)果表明，AHR富集的外泌體通過激活A(yù)HR/NLRP3信號通路，在減輕炎癥和細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮強大的心肌保護作用。

AHR-exo處理顯著促進了THP-1來源巨噬細(xì)胞的M2極化，同時抑制了M1表型（M2/M1比率增加約2.8倍）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示NLRP3、NF-κB和cleaved caspase-1表達(dá)顯著降低，同時AHR及其下游效應(yīng)分子CYP1A1和CYP1A2上調(diào)。ELISA結(jié)果顯示促炎細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-18）分泌減少，而抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β水平升高。這些發(fā)現(xiàn)表明，AHR-exo通過激活A(yù)HR信號和抑制NLRP3炎癥小體，將巨噬細(xì)胞重編程為抗炎表型。

在樹突狀細(xì)胞中，AHR-exo抑制了細(xì)胞活化和抗原呈遞，顯著下調(diào)了CD40、MHC II和OX62，同時顯著上調(diào)了抑制性配體CD274（PD-L1）。在T細(xì)胞中，AHR-exo使CD3⁺CD8⁺細(xì)胞毒性T細(xì)胞比例降低約80%，并使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺）增加約2.1倍。蛋白質(zhì)印跡和ELISA分析進一步驗證了AHR-exo的系統(tǒng)性抗炎作用，其顯著降低了炎癥相關(guān)蛋白（包括NLRP3、NF-κB和cleaved caspase-1）的表達(dá)，并減少了促炎細(xì)胞因子的分泌。這些結(jié)果表明，AHR富集的外泌體通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境、抑制炎癥信號和恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮全面的心肌保護作用。

本研究證明，源自AHR過表達(dá)hUC-MSCs的外泌體主要通過調(diào)節(jié)AHR/NLRP3信號軸和免疫調(diào)節(jié)來減輕H/R誘導(dǎo)的心肌損傷。AHR是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在心血管和免疫環(huán)境中，其激活已被證明可以限制心肌細(xì)胞凋亡并促進抗炎免疫極化。NLRP3炎癥小體是心肌缺血-再灌注損傷期間無菌炎癥的關(guān)鍵驅(qū)動因子。一個關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是，AHR富集的外泌體抑制了NLRP3炎癥小體的激活，這表現(xiàn)為NLRP3、caspase-1以及促炎細(xì)胞因子如IL-1β和IL-18的表達(dá)減少。

此外，AHR過表達(dá)外泌體還發(fā)揮了系統(tǒng)性免疫調(diào)節(jié)作用，促進M2巨噬細(xì)胞極化、抑制樹突狀細(xì)胞成熟并擴增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)變可能與NLRP3抑制協(xié)同作用，建立有利于組織修復(fù)的抗炎環(huán)境。本研究還提供了幾個顯著的優(yōu)勢和創(chuàng)新。它是首批設(shè)計hUC-MSCs過表達(dá)AHR并驗證AHR通過外泌體進行功能轉(zhuǎn)移的研究之一。AHR的雙重作用——減輕內(nèi)在心肌損傷同時重編程免疫反應(yīng)——為對抗缺血性損傷提供了多方面的治療策略。

盡管研究結(jié)果穩(wěn)健，但仍存在一些局限性。首先，雖然AHR激活持續(xù)抑制了NLRP3信號，但其精確的分子機制尚待闡明。其次，本研究主要在體外進行，簡化的共培養(yǎng)系統(tǒng)無法完全再現(xiàn)體內(nèi)環(huán)境的血流動力學(xué)、神經(jīng)激素和多細(xì)胞復(fù)雜性。第三，雖然我們關(guān)注了巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞，但其他免疫和非免疫細(xì)胞類型也可能有助于整體的炎癥重塑。最后，外泌體攜帶蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)的異質(zhì)性貨物，不能排除其他生物活性分子與AHR協(xié)同作用的可能性。

從轉(zhuǎn)化角度來看，這些發(fā)現(xiàn)支持工程化外泌體作為一種細(xì)胞無創(chuàng)、可定制的平臺用于心肌修復(fù)的治療潛力。與MSC移植相比，外泌體具有安全性更高、免疫原性更低和可擴展性更強等優(yōu)勢。AHR富集的外泌體可能特別適合作為再灌注治療的輔助手段，以降低損傷嚴(yán)重程度并促進免疫耐受。

本研究提供了新的見解，表明源自hUC-MSCs的AHR富集外泌體通過同時抑制NLRP3驅(qū)動的炎癥和重編程免疫反應(yīng)來減輕H/R誘導(dǎo)的心肌損傷。雖然這些發(fā)現(xiàn)推進了對外泌體療法的機制理解，但未來的工作應(yīng)側(cè)重于體內(nèi)驗證、全面的分子表征以及解決潛在的偏倚來源，以更好地指導(dǎo)臨床轉(zhuǎn)化。