一種新型腸道細菌Enterocloster sp. M3通過合成致癌物苯乙烯驅動結直腸癌發生
《Gut Microbes》：Novel bacterium Enterocloster sp. M3 promotes colorectal tumorigenesis via the production of the carcinogen styrene
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本文首次報道了從腺瘤患者中成功分離出的攜帶m3基因標記的腸道細菌M3（一種與Enterocloster aldenensis親緣相近但表型、基因組和功能均存在顯著差異的新型菌株），并通過動物實驗、細胞實驗及代謝組學等系列研究，系統揭示了M3通過合成致癌物苯乙烯(styrene)等多種腫瘤促進性代謝物，促進結直腸腫瘤發生的關鍵機制。研究發現，苯乙烯在CRC患者糞便中顯著升高，且在小鼠腸道中的暴露量超過WHO安全限值。尤為重要的是，研究首次闡明了M3體內合成苯乙烯的分子途徑，鑒定出兩個關鍵酶——天冬氨酸氨裂合酶(AAL)和尿卟啉原脫羧酶(UROD)，為后續開發靶向干預策略奠定了重要基礎，也為腸道菌群在腫瘤發生中的作用提供了嶄新視角。
M3的分離與鑒定
研究采用針對m3基因標記的富集培養策略，成功從一名73歲結腸腺瘤女性的樣本中分離出M3菌株。通過16S rDNA分析、全基因組測序、MALDI生物分型以及表型特征分析，發現M3與Enterocloster aldenensis在系統發育上關系密切，平均核苷酸同一性(ANI)達98.5%，但在多個方面存在明顯差異
。M3細胞形態更小，碳源利用譜不同，且最關鍵的是，完全不含m3 DNA序列。基于這些獨特的遺傳和表型特征，研究提出M3屬于Enterocloster屬，可能代表E. aldenensis的一個新菌株。
M3促進小鼠結腸腫瘤發生
通過向ApcMin/+小鼠和偶氮甲烷(AOM)處理的野生型小鼠灌胃M3，研究發現M3能顯著增加結腸腫瘤的發生率和大小，其促瘤效果強于E. aldenensis對照菌株。組織學檢查顯示，M3處理組小鼠結腸組織的異常增生和癌癥發生率最高。定量PCR(qPCR)結果表明，M3處理的ApcMin/+小鼠糞便中M3豐度逐漸增加，并且在終點時與腫瘤數量和大小呈正相關。這些結果表明，腸道菌群中的M3直接介導了促腫瘤效應。
M3分泌的代謝物促進結腸細胞、腫瘤移植物及腸類器官生長
研究表明，M3培養上清液中的非蛋白組分是發揮其致癌作用的關鍵介質。該上清液能夠顯著增強多種結腸癌細胞系以及永生化的結腸上皮細胞系NCM460的增殖、集落形成、遷移和侵襲能力。在皮下異種移植瘤模型中，瘤內注射M3上清液也顯著加速了腫瘤生長。值得注意的是，M3上清液還能刺激正常人類腸道類器官的擴增，表明M3通過分泌功能性代謝物介導其致癌作用。
M3通過失調宿主基因表達促進細胞增殖并損害DNA修復
RNA測序(RNA-seq)分析發現，與大腸桿菌(E. coli)處理相比，M3上清液處理的結腸癌細胞中，參與DNA損傷反應、DNA修復和G1-S期細胞周期調控的基因顯著失調。流式細胞術分析顯示，M3上清液加速了細胞的G1-S期轉換，同時細胞周期抑制劑p21表達降低，而G1-S期進程的關鍵調節因子CDK6、cyclin D1和磷酸化RB1的表達增加。Ki-67染色進一步證實，M3處理增加了未分化類器官中的增殖細胞比例。參與DNA修復和細胞周期停滯的關鍵基因Chk1被顯著下調。蛋白質印跡和免疫組化一致顯示，在M3處理后，結腸癌細胞、非腫瘤小鼠結腸組織和人類腸道類器官中，Chk1的磷酸化活化形式(pChk1)均顯著下調。這些發現表明，M3代謝物通過加速細胞周期進程和抑制DNA修復來發揮致癌作用。
非靶向與靶向代謝組學鑒定出M3產生的潛在致癌代謝物，尤其是苯乙烯
非靶向液相色譜-質譜聯用(LC-MS)代謝組學分析顯示，與對照培養基相比，M3上清液中有39種代謝物增加，76種減少。在增加的代謝物中，有8種特別值得關注：三種已知致癌物，包括苯乙烯(styrene)、2,6-二甲基苯胺和2-氨基萘；三種在CRC患者糞便中先前報道升高的潛在致癌代謝物，即鵝去氧膽酸、正纈氨酸和焦谷氨酸；以及兩種可能與苯乙烯相關的代謝物，即苯乙醛和4-羥基苯乙烯。其中，苯乙烯及其兩種衍生物以及2,6-二甲基苯胺位列增幅最大的前十大代謝物之中。靶向LC/GC-MS驗證證實，與對照（E. coli、E. aldenensis和肉湯）相比，M3上清液中苯乙烯、2,6-二甲基苯胺和焦谷氨酸的含量顯著增加。KEGG通路分析顯示，M3上清液中與酪氨酸和苯丙氨酸代謝相關的代謝物總體減少，而與苯乙烯降解通路相關的代謝物總體增加，進一步支持了苯乙烯的存在。
M3處理小鼠糞便中腫瘤促進性代謝物升高，其中苯乙烯尤為突出
提取M3處理小鼠糞便中的代謝物進行體外細胞培養發現，這些代謝物同樣能顯著促進結腸癌細胞和NCM460上皮細胞的增殖。隨后的非靶向代謝組學分析在M3處理小鼠的糞便中鑒定出25種增加和18種減少的代謝物，其中苯乙烯、苯乙醛、焦谷氨酸和尿嘧啶這四種代謝物在M3培養上清液和小鼠糞便中均升高
。除了苯乙醛，苯乙烯的另外兩種下游代謝物苯乙胺和扁桃酸在M3處理小鼠的糞便中也升高。優化的靶向氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)定量分析證實，M3處理小鼠糞便中的苯乙烯水平顯著高于對照組。按小鼠體重和糞便量推算，M3處理組小鼠平均每日苯乙烯暴露量達到12.5 μg/kg體重，超過了世界衛生組織(WHO)為人類設定的每日可耐受攝入量(7.7 μg/kg)。更重要的是，糞便中苯乙烯水平與M3豐度呈正相關。這些發現表明，M3在體內產生了具有生物學相關水平的苯乙烯。
人結直腸癌患者糞便代謝物中的苯乙烯水平顯著升高
研究分析了來自晚發型（≥50歲）和早發型（<50歲）CRC患者及其年齡匹配的對照者的糞便樣本的LC-MS非靶向代謝組學數據。結果發現，苯乙烯及其下游代謝物苯乙醛在晚發型和早發型CRC患者的糞便中均顯著升高。其中，苯乙烯最為突出，在晚發型和早發型CRC患者中分別較對照組增加了2.72倍和3.13倍。這表明腸道菌群衍生的苯乙烯可能參與了人類結直腸癌的發生。
M3中苯乙烯生物合成的酶學系統是首次報道的細菌苯乙烯生產途徑
作為在M3培養物和M3處理小鼠糞便中均發現的最突出的代謝物，苯乙烯是以前未報道過的細菌產物。KEGG通路分析追蹤了細菌利用飲食蛋白質和糖類通過多種途徑（酪氨酸代謝、莽草酸途徑生物堿合成、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成）合成苯丙氨酸的過程。已知某些真菌可通過苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)和反式肉桂酸脫羧酶(FDC)將苯丙氨酸轉化為反式肉桂酸(tCA)進而轉化為苯乙烯，但這一過程在細菌中未見報道
。
蛋白質組學和基因組學分析表明，M3擁有從蛋白質和糖類合成苯丙氨酸所需的所有8種酶。盡管這些酶與E. aldenensis對應酶序列同源性超過99%，但關鍵酶酪氨酸酚裂解酶在M3中的豐度高出250倍以上。盡管M3缺乏典型的PAL和FDC酶，但其PAL樣活性和tCA轉化為苯乙烯的活性顯著高于E. aldenensis和E. coli，提示M3中存在功能類似物。
新發現的酶AAL和UROD介導M3中苯乙烯合成的關鍵步驟
通過整合蛋白質組學和全基因組數據，研究確定了M3中負責將苯丙氨酸轉化為苯乙烯的酶。在PAL同工酶中，只有天冬氨酸氨裂合酶(AAL)在M3中的表達高于E. aldenensis。盡管M3-AAL與其同源的乳酸桿菌(L. paracasei) AAL序列相似性僅為55.6%，但保留了相同的功能域。在候選脫羧酶中，尿卟啉原脫羧酶(UROD)被確定為tCA轉化為苯乙烯酶的最主要候選者，其在M3中的表達水平顯著高于E. aldenensis。重組M3-AAL表現出較高的PAL樣活性，而其催化基序中的氨基酸序列被打亂后，該活性顯著降低。同樣，重組M3-UROD能高效催化tCA轉化為苯乙烯，而在Arg29和其他乙酸酯定位位點的突變則顯著削弱了這一活性。重要的是，從M3處理小鼠糞便中提取的蛋白質顯示PAL樣活性顯著升高，且該活性與糞便中M3的豐度呈正相關。這些結果共同闡明了M3首次報道的細菌苯乙烯合成的分子基礎。
