《Journal of Inflammation Research》：Standardized Extract of Flavonoids from Smilax glabra Alleviates Gouty Arthritis by Multi-Target Inhibition of Neutrophil Extracellular Traps via the Raf/ERK and Histone Citrullination Pathways
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本研究發現，土茯苓標準化黃酮類提取物（SFSG）通過靶向中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）形成，抑制Raf/ERK信號通路與組蛋白H3瓜氨酸化（CitH3），從而減輕痛風性關節炎（GA）關節腫脹與炎癥。該研究揭示了SFSG作為一種植物藥成分的多靶點治療潛力，為開發新型抗痛風藥物提供了實驗依據與全新思路。
研究背景與目的
痛風性關節炎（GA）是一種由尿酸鈉（MSU）結晶沉積引發的炎性關節疾病，當前治療方法在安全性、成本及長期應用方面存在局限。中性粒細胞作為關鍵的免疫細胞，在GA中被MSU激活后會釋放由DNA、組蛋白、髓過氧化物酶（MPO）和中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）等構成的網狀結構，稱為中性粒細胞胞外誘捕網（NETs），其在放大炎癥反應和組織損傷中扮演核心角色。Raf/ERK信號通路的激活會誘導活性氧（ROS）依賴的NETosis過程，其典型特征是組蛋白H3的瓜氨酸化（CitH3）。土茯苓是一種富含黃酮類成分的傳統中藥。本研究旨在探究其標準化黃酮類提取物（SFSG）是否能通過靶向NETs的形成來緩解GA，并闡明其涉及中性粒細胞驅動炎癥及相關信號通路的潛在機制。
實驗方法與模型
研究使用了MSU誘導的小鼠痛風性關節炎模型。通過腹腔注射抗Ly6G單克隆抗體（1A8）實現中性粒細胞耗竭，以驗證其在GA病理中的關鍵作用。SFSG（100， 200， 400 mg/kg）通過灌胃給藥7天，評估其對關節腫脹、組織病理學（HE染色）、中性粒細胞浸潤（免疫組化）及炎癥因子（IL-1β和IL-8， ELISA法檢測）的影響。
在體外，研究人員從健康志愿者外周血中分離出高純度（>94%）的人源中性粒細胞，并用MSU（500 μM）和PMA（50 nM）聯合刺激以誘導NETosis形成。通過CCK8法評估SFSG（0–200 μg/mL）的細胞毒性后，選取了50、100、200 μg/mL作為實驗濃度。利用免疫熒光染色和透射電鏡（TEM）觀察NETs的形態；通過Sytox Green熒光強度定量NETs釋放；檢測乳酸脫氫酶（LDH）釋放以評估細胞膜損傷；使用流式細胞術測量細胞內ROS水平；并通過Western blotting（WB）檢測Raf/ERK信號通路關鍵蛋白（p-Raf， p-ERK）及CitH3的表達變化。
主要研究結果
- 1.
中性粒細胞耗竭有效緩解GA炎癥：實驗證實，耗竭中性粒細胞可顯著減輕MSU誘導的關節腫脹和炎癥因子釋放，明確了中性粒細胞是GA病理進展的核心驅動因素。
- 2.
SFSG在體內有效減輕GA癥狀：在MSU誘導的GA小鼠模型中，SFSG能劑量依賴性地抑制踝關節腫脹。其中，高劑量SFSG（400 mg/kg）在注射后24小時將腫脹指數從58.36%降低至19.75%，抑制率約為66%，其效果與陽性對照藥秋水仙堿相當。組織病理學檢查顯示，SFSG治療顯著減少了關節內的白細胞浸潤和結構損傷。同時，關節組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的水平也得到顯著降低。
- 3.
SFSG在體外抑制NETs的形成與釋放：體外實驗表明，MSU+PMA刺激能顯著誘導中性粒細胞形成NETs，表現為明顯的網狀結構和Sytox Green熒光信號增強。SFSG預處理可劑量依賴性地抑制NETs的形成，在200 μg/mL濃度下可抑制約64%的NETs相關熒光強度，效果與50 nM秋水仙堿類似。這一抑制效果在從小鼠骨髓分離的中性粒細胞（BMNs）中也得到了驗證。
- 4.
SFSG減輕中性粒細胞損傷并抑制炎癥因子釋放：透射電鏡觀察發現，MSU+PMA刺激導致中性粒細胞核膜破裂和細胞質崩解，而SFSG處理能部分維持細胞超微結構的完整性。LDH釋放實驗證實SFSG能減少細胞膜損傷和細胞死亡。此外，SFSG還能顯著降低MSU+PMA刺激后中性粒細胞釋放的IL-1β、TNF-α和IL-8等促炎細胞因子水平。
- 5.
SFSG通過抑制ROS生成和Raf/ERK信號通路來抑制NETosis：流式細胞術分析顯示，SFSG能劑量依賴性地降低MSU+PMA誘導的中性粒細胞內ROS水平。Western blotting結果表明，SFSG處理下調了磷酸化Raf（p-Raf）和磷酸化ERK（p-ERK）的蛋白表達，同時降低了CitH3的蛋白水平。在經DMSO誘導分化的HL-60（dHL-60）細胞模型中，SFSG同樣表現出對Raf/ERK通路和CitH3的抑制作用，進一步證實了其作用機制。
- 6.
SFSG在體內抑制關節中性粒細胞浸潤及相關通路：在GA小鼠模型中，免疫組化（IHC）結果顯示SFSG減少了關節組織中MPO陽性細胞（即中性粒細胞）的浸潤。通過Sytox Green定量檢測，發現SFSG處理組關節滑液中NETs的形成也顯著減少。實時熒光定量PCR（qPCR）分析表明，MSU顯著上調了關節組織中PADI4和NOX2的mRNA表達，而SFSG能劑量依賴性地抑制這種上調。蛋白水平分析同樣證實，SFSG治療降低了關節組織中p-Raf、p-ERK以及CitH3的蛋白表達。
討論
本研究證實，SFSG通過多靶點作用機制緩解痛風性關節炎。其核心在于同時抑制了Raf/ERK信號通路的激活和下游的組蛋白H3瓜氨酸化過程，從而有效阻斷了NETosis的關鍵環節。相較于直接耗竭中性粒細胞或使用單一靶點抑制劑（如PADI4抑制劑Cl-amidine），SFSG這種多組分黃酮類提取物提供了協同、多層面的干預策略，既能抑制NETs形成和炎癥因子風暴，又能減少氧化應激和細胞損傷，同時可能保留中性粒細胞必要的宿主防御功能，顯示出作為新型植物藥療法的潛力。
結論
綜上所述，土茯苓標準化黃酮提取物（SFSG）通過靶向中性粒細胞驅動的炎癥反應，有效緩解了實驗性痛風性關節炎。其作用機制與抑制Raf/ERK信號通路、減少組蛋白H3瓜氨酸化及NETs形成、降低關節炎癥密切相關。SFSG對NOX2和PADI4的下調進一步支持了這一作用軸。這種多靶點特性使其區別于秋水仙堿等現有療法，凸顯了其作為基于植物化學的新型痛風管理候選藥物的潛力。
