《Journal of Inflammation Research》：ω-3 PUFAs Attenuate Postoperative Ileus by Modulating Macrophage Polarization via the JAK2/STAT3 Signaling Pathway
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本綜述探討了Omega-3多不飽和脂肪酸（ω-3 PUFAs）治療術后腸梗阻（Postoperative Ileus, POI）的效應與機制。研究表明，ω-3 PUFAs通過抑制巨噬細胞JAK2/STAT3信號通路的活化，從而抑制其向促炎M1表型的極化，減輕腸道局部炎癥，最終改善POI癥狀。這為POI的防治提供了新的潛在分子靶點與治療策略。
引言
術后腸梗阻（Postoperative Ileus, POI）是腹部手術后常見的并發癥，表現為胃腸道動力受損，臨床癥狀包括腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、不能耐受經口進食以及排便排氣困難。其發病機制涉及神經源性和炎癥性兩個階段，其中由巨噬細胞驅動的腸道炎癥是POI發病的核心。手術操作會誘導胃腸道巨噬細胞極化為促炎性的M1表型，并分泌白細胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥介質，這些因子會募集中性粒細胞，形成正反饋循環，加劇局部炎癥并損害胃腸平滑肌的收縮功能。JAK/STAT信號通路是巨噬細胞極化的關鍵調節通路，外部刺激可誘導JAK1和JAK2磷酸化，從而激活轉錄因子STAT1和STAT3，驅動M1巨噬細胞極化和炎癥細胞因子的產生。
Omega-3多不飽和脂肪酸（ω-3 PUFAs）是人體必需的脂肪酸，主要來源于深海生物（富含二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA）和陸地植物（富含α-亞麻酸ALA）。已有證據表明EPA和DHA具有顯著的抗炎特性，能夠抑制巨噬細胞分泌關鍵細胞因子，并可能通過調節脂質和能量代謝途徑來影響巨噬細胞極化。初步臨床研究也發現，術后早期給予ω-3 PUFAs腸內營養可減輕腸道炎癥，促進腸道功能恢復。然而，ω-3 PUFAs是否通過特異性調節巨噬細胞中的JAK2/STAT3信號通路來發揮其保護作用，尚不清楚。本研究旨在利用小鼠POI模型探討這一機制。
材料與方法
本研究采用了小鼠POI模型和體外巨噬細胞炎癥模型。實驗動物為C57BL/6小鼠，通過開腹手術并輕柔操作腸道10分鐘來建立POI模型。小鼠被隨機分為假手術組、POI模型組、ω-3 PUFAs低劑量組（ω3-L）和高劑量組（ω3-H）。術后通過灌胃給予ω-3 PUFAs魚油乳劑或生理鹽水。體外實驗使用RAW 264.7小鼠巨噬細胞系，用脂多糖（LPS）和干擾素-γ（IFN-γ）誘導其向M1表型極化，并加入EPA和DHA進行處理。評估指標包括：通過炭末推進實驗評估胃腸道動力；通過蘇木精-伊紅（H&E）染色觀察腸道組織病理學變化；通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和實時定量PCR（qRT-PCR）檢測炎癥細胞因子水平；通過免疫熒光染色和流式細胞術分析巨噬細胞浸潤和極化狀態；通過蛋白質印跡法（Western blot）和免疫組織化學檢測JAK2/STAT3信號通路相關蛋白的磷酸化水平。此外，還通過RNA測序（RNA-Seq）進行轉錄組分析，并利用CRISPR/Cas9技術和慢病毒轉導分別構建了STAT3敲除和過表達的巨噬細胞，以驗證該通路的關鍵作用。
結果
ω-3 PUFAs改善POI癥狀
在小鼠POI模型中，ω-3 PUFAs治療改善了臨床和組織學結局。與POI組相比，ω3-L和ω3-H組小鼠術后體重減輕更少。炭末推進實驗顯示，POI小鼠腸道傳輸率顯著降低，而ω-3 PUFAs可劑量依賴性地恢復胃腸道動力。同時，POI組腸道組織中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC）和肌球蛋白輕鏈（MLC）的表達降低，表明腸道收縮功能受損，而ω-3 PUFAs處理增加了這些蛋白的表達。H&E染色顯示，POI小鼠回腸組織出現嚴重的粘膜損傷，包括上皮脫落、固有層暴露、炎性細胞浸潤和血管充血/水腫，這些病理變化在ω-3 PUFAs治療組中得到顯著改善。
ω-3 PUFAs減少腸道巨噬細胞浸潤并抑制局部炎癥
免疫熒光染色顯示，POI小鼠回腸組織中巨噬細胞（F4/80+）浸潤顯著增加，而ω-3 PUFAs治療可顯著減少這種浸潤。ELISA和qRT-PCR結果表明，ω-3 PUFAs可劑量依賴性地降低回腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白和mRNA水平。這些發現表明，ω-3 PUFAs通過限制巨噬細胞浸潤和抑制促炎細胞因子的產生來減輕POI中的腸道炎癥。
ω-3 PUFAs在體外抑制M1巨噬細胞極化和促炎細胞因子分泌
在炎癥條件下，用ω-3 PUFAs處理RAW 264.7細胞。細胞活性檢測表明，100 μM EPA和50 μM DHA處理24小時對細胞活力無影響。流式細胞術分析顯示，ω-3 PUFAs處理可顯著降低LPS+IFN-γ誘導的M1標志物CD86的表達，但對M2標志物CD206的表達無顯著影響。同時，ELISA和qRT-PCR分析表明，ω-3 PUFAs可顯著降低LPS+IFN-γ誘導的IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌和mRNA表達。這表明ω-3 PUFAs可抑制巨噬細胞向促炎M1亞型的極化，并減少主要炎癥細胞因子的分泌。
轉錄組分析提示JAK2-STAT3信號參與ω-3 PUFAs的作用機制
對對照組（CON）、M1極化組和ω-3 PUFAs處理組巨噬細胞進行RNA測序。主成分分析（PCA）確認了三組具有不同的轉錄組特征。差異表達基因分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析表明，JAK-STAT信號通路在M1組巨噬細胞中被激活，而在ω-3 PUFAs處理組中，與該通路相關的基因表達下調。三組間的比較分析顯示，JAK2和STAT3在M1組表達升高，而在ω-3 PUFAs處理后其表達被抑制。這些結果提示，ω-3 PUFAs可能通過調節JAK2/STAT3信號通路發揮作用。
ω-3 PUFAs在體內外抑制JAK2/STAT3磷酸化
蛋白質印跡分析顯示，在LPS+IFN-γ刺激的巨噬細胞中，M1組JAK2、STAT3和p65的磷酸化水平顯著升高，而ω-3 PUFAs處理可顯著抑制這三種蛋白的磷酸化。同樣，在POI小鼠的回腸組織中，免疫組織化學和蛋白質印跡結果顯示，與假手術組相比，POI組p-JAK2、p-STAT3和p-p65水平升高，而ω-3 PUFAs治療可劑量依賴性地降低這些信號分子的磷酸化水平。這些數據表明，POI涉及JAK2/STAT3軸的激活，而ω-3 PUFAs在體內外均可抑制該通路。
STAT3敲除與ω-3 PUFAs協同抑制M1極化
利用CRISPR/Cas9技術構建了STAT3敲除的RAW 264.7細胞。蛋白質印跡驗證了總STAT3和磷酸化STAT3的缺失。流式細胞術顯示，STAT3敲除本身就能顯著降低LPS+IFN-γ誘導的CD86表達，而STAT3敲除聯合ω-3 PUFAs處理幾乎完全消除了CD86的表達。同樣，STAT3敲除顯著降低了IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌蛋白和mRNA水平，并且ω-3 PUFAs進一步增強了這種抑制作用。這些發現證實STAT3是M1極化和細胞因子產生的關鍵調節因子，其抑制與ω-3 PUFAs具有協同作用。
STAT3過表達部分逆轉ω-3 PUFAs的抗炎作用
在RAW 264.7細胞中過表達STAT3。蛋白質印跡證實STAT3過表達成功并增加了STAT3的磷酸化。STAT3過表達顯著增強了LPS+IFN-γ誘導的CD86表達，并且關鍵性地削弱了ω-3 PUFAs抑制CD86表達的能力。此外，STAT3過表達增加了IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白和mRNA水平，顯著減弱了ω-3 PUFAs對細胞因子產生的抑制作用。這些結果進一步證實，抑制JAK2/STAT3信號通路是ω-3 PUFAs抑制M1極化和炎癥反應的主要機制。
討論
本研究證實，ω-3 PUFAs能夠改善POI小鼠的胃腸道動力和腸道組織損傷，其機制與減少腸道巨噬細胞浸潤、抑制局部炎癥密切相關。體外實驗進一步明確，ω-3 PUFAs可直接抑制巨噬細胞向促炎M1表型的極化。通過RNA測序、信號通路蛋白檢測以及遺傳學功能增益和功能缺失實驗，本研究首次系統性地揭示了ω-3 PUFAs通過抑制巨噬細胞內JAK2/STAT3信號通路的活化，進而調控其極化狀態，是其發揮抗炎、保護腸道功能的核心分子機制。盡管先前研究提示ω-3 PUFAs可能通過其他通路（如MAPK、NF-κB、PPARγ）發揮抗炎作用，但本研究的遺傳學證據確立了JAK2/STAT3通路在此過程中的關鍵地位。當然，本研究也存在一定局限，例如機制分析主要集中在巨噬細胞，未深入探討其他免疫細胞的作用；使用的RAW 264.7細胞缺乏炎癥小體適配蛋白ASC，可能低估了ω-3 PUFAs對IL-1β成熟的影響；ω-3 PUFAs或其代謝物與JAK2/STAT3通路相互作用的精確分子細節仍有待闡明。
結論
綜上所述，本研究表明ω-3 PUFAs通過抑制腸道巨噬細胞中的JAK2/STAT3信號通路，阻止其向促炎M1表型極化，從而減輕局部炎癥反應，最終緩解術后腸梗阻。這為ω-3 PUFAs作為POI預防或治療的潛在藥物提供了新的理論依據和分子靶點。
