近年來，L-精氨酸對人類健康相關(guān)微生物生理的影響備受關(guān)注。精氨酸在蛋白質(zhì)合成等基礎(chǔ)生理過程中至關(guān)重要，并且越來越多的證據(jù)表明它影響微生物穩(wěn)態(tài)、心血管維持和腫瘤發(fā)生等過程。因此，精氨酸被視為一種極具前景的益生素，可用于促進(jìn)人類健康及疾病干預(yù)，盡管其代謝及代謝影響的許多方面仍有待闡明。唾液和牙菌斑中游離精氨酸水平的變化，以及精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)（ADS）陽性細(xì)菌的流行與活性，其更廣泛的意義尚未完全被理解。作為牙菌斑中最豐富的細(xì)菌群，大量口腔鏈球菌具有從頭合成精氨酸所需的基因，但并非所有菌種都能通過ADS降解精氨酸。當(dāng)前對口腔鏈球菌精氨酸代謝的理解主要源于對戈登鏈球菌（S. gordonii）的研究，認(rèn)為無氧條件和完整的arcB基因是其在不含精氨酸的培養(yǎng)基中生長的關(guān)鍵。然而，包括血鏈球菌（S. sanguinis）在內(nèi)的其他口腔鏈球菌的精氨酸代謝特性，尤其是對精氨酸及其代謝產(chǎn)物的異質(zhì)性響應(yīng)，仍不清楚。

為研究血鏈球菌同化外源精氨酸或從頭合成精氨酸的能力，研究首先使用實(shí)驗(yàn)室菌株SK36進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)，無氧條件下，SK36可在不含精氨酸的培養(yǎng)基中生長，但在有氧條件下則不能。然而，添加微量精氨酸（5 μM）即可顯著促進(jìn)其有氧生長，添加少量（1%， v/v）的廢培養(yǎng)基也有類似效果，暗示微量的精氨酸或其他代謝產(chǎn)物能增強(qiáng)SK36從頭合成精氨酸的能力。由于血鏈球菌與戈登鏈球菌類似，擁有ADS操縱子但缺乏合成型鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶（OTCase），因此可能依賴ADS中的分解型OTCase（ArcB）催化逆反應(yīng)：L-鳥氨酸 + 氨甲酰磷酸 → L-瓜氨酸，隨后瓜氨酸再轉(zhuǎn)化為精氨酸。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加鳥氨酸（最低50 μM）能穩(wěn)定地促進(jìn)SK36的有氧生長，并且這種促進(jìn)作用在與微量精氨酸聯(lián)用時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)。使用ADS關(guān)鍵基因（arcA、arcB、arcC、arcD）的等基因突變株進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示arcB的缺失消除了鳥氨酸的促生長效應(yīng)，而arcD（精氨酸/鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的缺失則導(dǎo)致菌株在低濃度精氨酸（50 μM）下無法生長。這表明，鳥氨酸是ArcB催化合成反應(yīng)的重要底物，而ArcD在精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)中起主要作用。

為驗(yàn)證其他口腔鏈球菌是否也能利用鳥氨酸和ArcB活性促進(jìn)精氨酸合成，研究評估了一系列ADS陽性口腔鏈球菌在有無精氨酸（50 μM， 0.5 mM）和鳥氨酸（0.5 mM）條件下的生長情況600值。">。測試菌株包括16株血鏈球菌、5株戈登鏈球菌以及多株緩癥鏈球菌（S. mitis）、齒狀鏈球菌（S. dentisani）、口腔鏈球菌（S. oralis）和嵴鏈球菌（S. cristatus）的臨床分離株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不含精氨酸和鳥氨酸的條件下，16株血鏈球菌臨床分離株中有7株在無氧條件下能檢測到生長，但在有氧條件下均無法生長。與此同時(shí)，其他9株血鏈球菌以及所有測試的戈登鏈球菌、緩癥鏈球菌、齒狀鏈球菌、口腔鏈球菌和嵴鏈球菌均無法生長。大多數(shù)測試菌株在補(bǔ)充>50 μM精氨酸后，無論有氧無氧，均能正常生長。值得注意的是，補(bǔ)充0.5 mM鳥氨酸能為大多數(shù)血鏈球菌和所有5株戈登鏈球菌提供與50 μM精氨酸相當(dāng)?shù)纳�長支持，且這種促進(jìn)作用在無氧條件下更為顯著。然而，所有測試的緩癥鏈球菌、齒狀鏈球菌、口腔鏈球菌和嵴鏈球菌分離株均未對0.5 mM鳥氨酸產(chǎn)生響應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)，預(yù)先用TY-Gal/Arg培養(yǎng)基誘導(dǎo)ADS表達(dá)后，大部分血鏈球菌分離株喪失了在無精氨酸和鳥氨酸條件下的無氧生長能力。這提示，無論OTCase（ArcB）表達(dá)水平如何，大多數(shù)非變異鏈球菌口腔鏈球菌需要一定量的外源精氨酸或鳥氨酸來啟動(dòng)精氨酸的生物合成。觀察到的這種異質(zhì)性可能歸因于精氨酸或鳥氨酸的感知與轉(zhuǎn)運(yùn)、ArcB活性等因素。

研究進(jìn)一步評估了ArcB在精氨酸或鳥氨酸充足條件下的作用。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)ADS表達(dá)增強(qiáng)了幾乎所有測試菌株（除BCC39外）在鳥氨酸上的生長。然而，ADS活性較高的菌株在鳥氨酸上的生長表現(xiàn)并不總是優(yōu)于活性較低的菌株。在精氨酸存在的情況下，表型更為復(fù)雜。例如，預(yù)先誘導(dǎo)ADS表達(dá)的SK36在50 μM精氨酸中的生長反而低于未誘導(dǎo)的對照，研究者推測ADS的過度表達(dá)可能以犧牲精氨酸合成為代價(jià)，影響了整體適應(yīng)性。不同菌株甚至同一物種的不同譜系可能已經(jīng)進(jìn)化出不同的策略來平衡精氨酸合成和通過ADS產(chǎn)堿的需求。

與這些非變異鏈球菌不同，研究測試的六株變異鏈球菌均能在不含精氨酸和鳥氨酸的FMC-ADO培養(yǎng)基中生長，無論有氧與否。有趣的是，變異鏈球菌對鳥氨酸（50 μM 到 1 mM）的響應(yīng)可分為三種表型：第一組以UA159為代表，其最終產(chǎn)量隨鳥氨酸濃度增加而增加，但生長速率基本不變；第二組包括OMZ175、ST1和U2A，最終產(chǎn)量相似但倍增時(shí)間隨鳥氨酸濃度增加而增加；第三組以SM6為代表，生長參數(shù)基本不受鳥氨酸影響。這表明，與許多能利用鳥氨酸的產(chǎn)堿共生鏈球菌相比，變異鏈球菌針對這種分解代謝產(chǎn)物進(jìn)化出了不同的策略。

由于變異鏈球菌缺乏arcB基因，研究分析了UA159基因組中合成型OTCase的候選基因。同源性分析發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)重要候選：SMU.563（暫稱argF）與SK36的arcB具有高度序列同一性；另一個(gè)相似度較低的基因是aguB。缺失argF會導(dǎo)致UA159失去在FMC-ADO中生長的能力，也無法在5 μM精氨酸存在時(shí)對鳥氨酸產(chǎn)生響應(yīng)。而在UA159_ΔargF背景下回補(bǔ)野生型argF基因，則恢復(fù)了其不依賴精氨酸生長的能力以及對鳥氨酸的響應(yīng)。因此，argF是UA159從頭合成精氨酸或利用鳥氨酸實(shí)現(xiàn)相同目的所必需的。

作為一種補(bǔ)償argF功能缺失的替代機(jī)制，研究測試了瓜氨酸（合成型OTCase的產(chǎn)物）能否挽救UA159_ΔargF和OMZ175_Δcnm_ΔargF的生長缺陷。正如預(yù)期，0.5 mM瓜氨酸挽救了兩個(gè)argF突變株在FMC-ADO中的生長缺陷。重要的是，當(dāng)瓜氨酸添加到UA159和OMZ175的培養(yǎng)物中時(shí)，兩者都表現(xiàn)出生長改善（倍增時(shí)間縮短，最終OD₆₀₀更高），這與它們對鳥氨酸的菌株特異性效應(yīng)形成了對比。這表明，鳥氨酸不僅為精氨酸合成提供底物，還可能觸發(fā)了某些未知的、能差異性影響變異鏈球菌適應(yīng)性的機(jī)制。

當(dāng)測試瓜氨酸對血鏈球菌SK36和戈登鏈球菌DL1的效應(yīng)時(shí)，0.5 mM瓜氨酸對兩者的益處與0.5 mM鳥氨酸相似，但程度有限。然而，與鳥氨酸不同的是，5 μM精氨酸與0.5 mM瓜氨酸的組合能使兩種菌株的生長恢復(fù)到接近0.5 mM精氨酸單獨(dú)支持的水平。這種協(xié)同效應(yīng)在多個(gè)臨床分離株中也得到證實(shí)。對于大多數(shù)血鏈球菌和戈登鏈球菌菌株而言，單獨(dú)的瓜氨酸無法挽救其精氨酸從頭合成，這表明除了ArcB之外，將瓜氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸的反應(yīng)（由argG和argH編碼）也是這些細(xì)菌精氨酸營養(yǎng)缺陷的另一個(gè)促成因素。

為了解調(diào)控精氨酸代謝的機(jī)制，研究對血鏈球菌和變異鏈球菌中精氨酸合成（arg）和ADS介導(dǎo)的降解（arc）相關(guān)途徑進(jìn)行了一系列轉(zhuǎn)錄分析。

在血鏈球菌SK36中，無氧處理顯著上調(diào)了arc途徑（5至7倍），而震蕩（增加氧氣暴露）逆轉(zhuǎn)了這種上調(diào)。與此同時(shí)，精氨酸或鳥氨酸含量的差異并未顯著改變arc基因表達(dá)。而arg途徑的mRNA水平（argB、argC、argH）首先因無氧環(huán)境而降低（6至17倍），震蕩后進(jìn)一步降低。此外，精氨酸濃度從25 μM增加到0.5 mM使argmRNA水平降低11至13倍，這與生物合成基因典型的負(fù)反饋調(diào)節(jié)一致。相比之下，向含有25 μM精氨酸的培養(yǎng)基中添加0.5 mM鳥氨酸僅使arg基因表達(dá)降低約2倍。這種精氨酸和鳥氨酸效應(yīng)的明顯差異表明，它們可能通過不同的機(jī)制影響血鏈球菌的基因調(diào)控。

在變異鏈球菌中，精氨酸和鳥氨酸（0.5 mM）處理均能強(qiáng)烈且一致地降低UA159和OMZ175菌株中四個(gè)arg基因（argB、argC、argF、argH）的mRNA水平，兩者之間或菌株之間無明顯差異。這表明在變異鏈球菌中，這兩種底物可能直接或間接地觸發(fā)了相同的調(diào)控回路來控制精氨酸的生物合成。先前研究曾發(fā)現(xiàn)果糖處理能顯著上調(diào)UA159中的arg途徑。對于血鏈球菌SK36，缺失葡萄糖-PTS基因（manL）會影響arg和arc途徑。這些數(shù)據(jù)描繪了碳水化合物對這兩種口腔微生物群中競爭性鏈球菌的精氨酸代謝具有截然不同的影響圖景。

考慮到SK36獨(dú)特的不依賴精氨酸無氧生長能力，研究探討了某些遺傳變異是否促成了其更強(qiáng)的精氨酸從頭合成能力。在生長分析中，發(fā)現(xiàn)了某些SK36培養(yǎng)物在鳥氨酸上表現(xiàn)出增強(qiáng)的生長。對其中一個(gè)群體（SK36-C9）進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了一些可能影響精氨酸代謝的氨基酸替換。最有趣的是，在一個(gè)編碼假定蛋白的ORF（SSA_1381）中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)不同的氨基酸替換。該基因是僅存在于血鏈球菌物種中的一個(gè)三基因基因座的一部分。計(jì)算機(jī)建模（AlphaFold）顯示，SSA_1381、SSA_1380和SSA_1379共同形成了一個(gè)具有顯著對稱結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)復(fù)合物，而SSA_1381中的5個(gè)氨基酸替換深刻地改變了預(yù)測結(jié)構(gòu)。雖然其中一些SNP可能無關(guān)，但其他突變指向了增強(qiáng)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)或氨甲酰磷酸的產(chǎn)生，以支持精氨酸生物合成。考慮到SNP在傳代血鏈球菌菌株中常見積累，某些SNP可能確實(shí)促進(jìn)了SK36在缺乏精氨酸和鳥氨酸條件下的生長能力。

本研究側(cè)重于口腔鏈球菌分解代謝游離精氨酸及其代謝產(chǎn)物。包括戈登鏈球菌和血鏈球菌在內(nèi)的許多鏈球菌能有效利用肽形式的精氨酸，考慮到口腔中游離精氨酸的有限可用性，這一能力尤為重要。同樣，在如此低的水平下，精氨酸的有效轉(zhuǎn)運(yùn)對于誘導(dǎo)口腔鏈球菌中的ADS可能至關(guān)重要。值得注意的是，精氨酸/鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ArcD）的活性需要細(xì)胞內(nèi)鳥氨酸的可用性。盡管本研究表明鳥氨酸能在無精氨酸條件下促進(jìn)血鏈球菌和戈登鏈球菌的生長，但其對精氨酸攝取的影響需要在精氨酸生物合成的背景下加以考慮。

目前對口腔鏈球菌的理解主要源于戈登鏈球菌的研究，認(rèn)為精氨酸從頭生物合成的關(guān)鍵是編碼OTCase的arcB基因的充分表達(dá)，這一能力通常由無氧環(huán)境滿足。本研究的一個(gè)新發(fā)現(xiàn)是，即使arcB完整且表達(dá)充分，血鏈球菌、戈登鏈球菌以及可能其他幾種共生鏈球菌的生長仍需要一定量的外源精氨酸或其代謝產(chǎn)物鳥氨酸或瓜氨酸。這一發(fā)現(xiàn)與之前唾液精氨酸水平升高與齲齒發(fā)病率降低相關(guān)的研究報(bào)告相吻合，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)需要精氨酸或鳥氨酸生長的許多菌種被認(rèn)為有益于微生物穩(wěn)態(tài)和口腔健康。考慮到唾液中精氨酸的總體穩(wěn)態(tài)水平較低，它可能更多地通過維持共生菌的精氨酸合成而非支持其ADS活性來使共生菌受益，正如我們所展示的，過度活躍的ADS可能以低精氨酸條件下共生菌的適應(yīng)性為代價(jià)。采用相反策略的變異鏈球菌似乎不依賴外源精氨酸生長，然而其適應(yīng)性和行為可能受到精氨酸，尤其是鳥氨酸可用性的顯著調(diào)節(jié)。理論上，口腔中精氨酸及相關(guān)化合物可用性的變化，以及微生物相關(guān)代謝能力的異質(zhì)性，可能深刻影響微生物穩(wěn)態(tài)以及人類對菌群失調(diào)或穩(wěn)態(tài)微生物組的易感性。盡管精氨酸營養(yǎng)缺陷和異質(zhì)性背后的確切機(jī)制仍有待闡明，但本研究揭示了口腔細(xì)菌精氨酸代謝方面的重大知識空白。隨著精氨酸日益被視為益生素，而ADS陽性口腔鏈球菌被視為益生菌，迫切需要對口腔細(xì)菌的精氨酸代謝及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行基礎(chǔ)研究。例如，被測試為益生菌的鏈球菌物種的一個(gè)共同限制是其在人體內(nèi)的定植和/或益處的短暫性，這強(qiáng)調(diào)需要更好地了解有助于其競爭適應(yīng)性的因素。雖然唾液和齦上菌斑中的ADS因其pH調(diào)節(jié)作用而被廣泛認(rèn)為具有抗齲性，但其對牙周病原體（尤其是牙齦卟啉單胞菌）的生態(tài)影響，結(jié)合牙齦卟啉單胞菌中肽基精氨酸脫亞胺酶（PPAD）以及唾液中人類精氨酸酶的活性，與牙周病進(jìn)展相關(guān)。這造成了精氨酸代謝在齲病與牙周炎作用中的悖論。未來，需要對精氨酸代謝進(jìn)行更深入的機(jī)制研究，特別是通過對比口腔致病菌與健康相關(guān)共生菌之間的機(jī)制。在微生物組層面，鳥氨酸作為一種潛在的代謝信號分子已被證明能影響某些牙周病原體的適應(yīng)性和毒力。我們的研究表明，鳥氨酸和瓜氨酸介導(dǎo)的代謝相互作用可能同時(shí)存在于牙齦線上方和下方，其全部復(fù)雜性和生態(tài)影響尚待闡明。