《Redox Report》：Artesunate ameliorates experimental autoimmune uveitis by inhibiting the LCN2-STAT3 axis and suppressing microglial activation
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本研究聚焦青蒿琥酯對實驗性自身免疫性葡萄膜炎的療效與機制，通過體內外實驗證實ART通過靶向LCN2-STAT3信號軸，有效抑制小膠質細胞（IBA1+）的M1極化（iNOS+）及炎性因子（IL-1β, IL-6, TNF-α, IL17A）釋放，從而減輕視網膜炎癥浸潤與結構損傷，為自身免疫性眼病提供了新的潛在治療靶點與候選藥物。
研究目的與背景
實驗性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveitis, EAU）是一種威脅視力的眼內炎癥性疾病模型，與人類自身免疫性葡萄膜炎（Autoimmune Uveitis, AU）具有相似的病理特征。目前以糖皮質激素為代表的傳統療法存在耐藥、復發和副作用等局限。青蒿琥酯（Artesunate, ART）作為青蒿素的水溶性衍生物，以其良好的安全性、生物利用度及抗炎、抗氧化等生物學活性，在治療多種自身免疫性疾病中展現出潛力。本研究旨在系統評估ART對EAU的治療效果，并深入探究其作用機制。
材料與方法
研究使用B10.RIII小鼠建立EAU模型，設立對照組、EAU組、ART治療組（口服，50 mg/kg/天，第7-14天）及LCN2抑制劑組（玻璃體內注射）進行比較。通過裂隙燈生物顯微鏡臨床評分和蘇木精-伊紅（H&E）染色組織病理學評分評估疾病嚴重程度。利用表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）分析ART與LCN2及STAT3蛋白的直接結合。通過RNA轉錄組測序分析差異表達基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。采用蛋白質免疫印跡（Western Blot）和酶聯免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）檢測視網膜及BV2小膠質細胞培養上清中多種蛋白（LCN2, STAT3, p-STAT3, IBA1, iNOS, FTH1, SLC7A11, GPX4, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL17A）的表達與炎性因子水平。運用免疫熒光共染技術評估視網膜組織中LCN2與小膠質細胞標志物IBA1、星形膠質細胞標志物GFAP以及CD4+T細胞與IL17A的共定位情況。通過活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）染色和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性測定評估氧化應激水平。在體外，使用脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）刺激BV2小膠質細胞建立炎癥模型，并通過siRNA敲低LCN2表達以驗證其功能。
研究結果
- 1.
ART有效減輕EAU炎癥：與EAU組相比，ART治療顯著改善了小鼠前段血管炎的臨床癥狀和視網膜組織病理學評分，同時顯著下調了視網膜中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達與分泌水平。
- 2.
ART下調LCN2表達并與之直接結合：RNA測序及蛋白分析顯示，EAU誘導后視網膜LCN2表達顯著升高，而ART治療可顯著抑制其表達。SPR分析證實ART能夠以中等親和力直接結合LCN2（KD= 23.8 μM）和STAT3（KD= 71.9 μM）。
- 3.
抑制LCN2可模擬ART的治療效果：玻璃體內注射LCN2抑制劑能夠顯著減輕EAU的臨床癥狀和組織損傷，其效果與ART治療相似，并能同等程度地下調視網膜中LCN2及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達。
- 4.
ART與LCN2抑制劑均能減輕氧化應激：EAU誘導后，視網膜中ROS水平顯著升高，SOD活性下降。ART和LCN2抑制劑治療均能有效抑制ROS累積并恢復SOD活性。
- 5.
ART與LCN2抑制劑抑制小膠質細胞活化：免疫熒光共染顯示，在EAU視網膜中，LCN2與小膠質細胞標志物IBA1存在明顯的共定位，表明活化的小膠質細胞是LCN2的主要來源。ART和LCN2抑制劑治療均能顯著減少IBA1和M1型標志物iNOS的表達，抑制小膠質細胞的活化。
- 6.
ART與si-LCN2在體外抑制BV2細胞的炎癥反應：在LPS刺激的BV2小膠質細胞中，1 μM ART處理或siRNA敲低LCN2均能有效抑制LCN2蛋白的上調，并降低炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。
- 7.
ART通過抑制STAT3/Th17軸發揮作用：EAU視網膜中STAT3及其磷酸化形式p-STAT3以及Th17細胞相關因子IL17A的表達顯著升高。ART和LCN2抑制劑治療均能有效下調STAT3、p-STAT3和IL17A的水平，并減少CD4+T細胞與IL17A的共定位。
結論
本研究揭示，青蒿琥酯（ART）通過直接靶向并下調LCN2（Lipocalin-2），進而抑制STAT3信號通路的活化，發揮其治療EAU的作用。這一機制最終導致視網膜中小膠質細胞的M1型極化被抑制，促炎細胞因子（如IL-1β, IL-6, TNF-α）和Th17細胞相關因子IL17A的產生減少，氧化應激水平（ROS）下降，從而有效緩解視網膜炎癥、減少組織損傷并維持結構完整。該研究為ART應用于自身免疫性葡萄膜炎的臨床治療提供了重要的臨床前證據和分子機制闡釋。
