膿毒癥（Sepsis）是全球范圍內一個重大的臨床挑戰，其發病率和死亡率居高不下。在膿毒癥的眾多并發癥中，膿毒癥誘導的心肌損傷（Sepsis-induced myocardial injury, SIMI）是導致患者不良預后的關鍵因素，但其分子機制尚未完全闡明。硫化氫（Hydrogen sulfide, H₂S）是一種重要的內源性氣體信號分子，在心血管穩態中發揮關鍵作用。蛋白硫水化（Protein S-sulfhydration）是H₂S調控蛋白質功能的重要翻譯后修飾機制。鐵死亡（Ferroptosis）是一種鐵依賴性的、由脂質過氧化驅動的程序性細胞死亡形式，已被證實在SIMI的發病機制中扮演重要角色。本研究旨在深入探索H₂S通過蛋白硫水化修飾調控HIF1α（Hypoxia-inducible factor 1-alpha）通路從而抑制鐵死亡，進而減輕SIMI的具體分子機制，并評估天然產物大蒜素（Allicin）的治療潛力。

研究采用了體內和體外膿毒癥模型。體內模型使用雄性C57/BL6小鼠，通過盲腸結扎穿孔術（Cecal ligation and puncture, CLP）建立SIMI模型。實驗還使用了心肌細胞特異性CSE敲除（CSE-cKO）小鼠。體外模型使用AC16人心肌細胞，以脂多糖（LPS）刺激模擬膿毒癥環境。主要干預手段包括使用外源性H₂S供體GYY4137以及天然H₂S供體大蒜素。通過超聲心動圖評估心功能，采用蛋白質印跡法（Western blot）、實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）、免疫熒光染色、透射電子顯微鏡、酶聯免疫吸附測定（ELISA）等技術檢測相關蛋白表達、細胞死亡、炎癥因子和鐵死亡標志物。使用生物素轉換法（Biotin-switch assay）檢測蛋白硫水化水平。通過定點突變、免疫共沉淀（Co-IP）和基因沉默/過表達等技術驗證HSPA8（Heat shock protein family A (Hsp70) member 8）與HIF1α的相互作用及Cys574位點的功能。

在心肌細胞中，LPS刺激顯著降低了胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionine-γ-lyase, CSE）的蛋白和mRNA水平以及內源性H₂S含量，表明膿毒癥抑制了CSE/H₂S通路。外源性H₂S供體GYY4137能劑量依賴性地恢復細胞活力，并降低LPS誘導的促炎細胞因子（IL-1β， IL-6， IL-8， TNF-α）和心肌損傷標志物（LDH， CK-MB， cTn-l）的釋放。在動物模型中，CLP手術同樣降低了心臟組織CSE表達和血清H₂S水平。CSE敲除加劇了CLP引起的心肌細胞凋亡（TUNEL陽性增加）、心功能不全（射血分數EF和縮短分數FS下降）及心肌組織結構破壞。而GYY4137處理能顯著改善這些病理變化。

在多種程序性細胞死亡抑制劑中，鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 (Fer-1)對LPS誘導的心肌細胞活力下降保護作用最顯著。LPS刺激導致鐵死亡關鍵蛋白GPX4（Glutathione peroxidase 4）表達下調，細胞內Fe²⁺和脂質過氧化產物丙二醛（MDA）水平升高，這些標志物的變化在CSE敲低后加劇，而GYY4137處理能逆轉。在體實驗中，CLP小鼠心肌GPX4表達下降，Fe²⁺和MDA積聚，CSE缺失加重了這些鐵死亡特征，GYY4137則起到保護作用。使用鐵死亡誘導劑Erastin可以取消GYY4137的保護效應，而敲低GPX4同樣廢除了H₂S對心肌損傷和炎癥的緩解作用，證實H₂S主要通過抑制鐵死亡發揮心臟保護功能。此外，體內應用Fer-1能顯著改善CLP小鼠的心功能、減輕心肌損傷和線粒體結構破壞。

研究發現，膿毒癥條件下心肌組織和細胞中HIF1α蛋白表達顯著上調，而GYY4137處理能有效降低其表達。功能獲得和功能缺失實驗證實，敲低HIF1α可以模擬GYY4137的保護作用，恢復GPX4表達，降低Fe²⁺和MDA水平；而過表達HIF1α則廢除了GYY4137對鐵死亡的抑制作用。在體實驗進一步表明，HIF1α敲低減輕了CLP誘導的心肌細胞死亡、心肌損傷評分升高、血清心肌酶釋放以及心功能下降和線粒體損傷，而過表達HIF1α則逆轉了GYY4137的這些保護效益。細胞實驗也得到一致結果，HIF1α敲低能改善細胞活力，減少損傷標志物和炎癥因子釋放，而過表達則抵消H₂S的保護作用。

BNIP3是HIF1α的已知下游靶基因。研究發現，在CLP和LPS模型中，BNIP3的表達均顯著上調，而GYY4137處理能抑制其表達。HIF1α的敲低或過表達能相應地降低或升高BNIP3的mRNA水平，證實了BNIP3受HIF1α轉錄調控。功能上，激活HIF1α（使用激動劑FZ）會加劇LPS引起的細胞活力下降、鐵死亡標志物（Fe²⁺， MDA）累積以及心肌損傷標志物（LDH， CK-MB， cTn-l）釋放，而敲低BNIP3則能顯著緩解這些損傷。

機制探索發現，GYY4137不影響HIF1α的mRNA水平，提示其調控發生在蛋白質層面。通過篩選與HIF1α相互作用的硫水化蛋白，分子伴侶HSPA8被鑒定為關鍵靶點。質譜分析確認HSPA8的Cys574位點發生硫水化修飾。生物素轉換實驗證實，膿毒癥條件下HSPA8的硫水化水平降低，而GYY4137處理可恢復其修飾。免疫共沉淀實驗證明HIF1α與HSPA8存在相互作用，且這種相互作用在LPS刺激后減弱，經GYY4137處理后增強。關鍵的是，將HSPA8的Cys574位點突變為絲氨酸（C574S）后，H₂S無法再促進HIF1α與HSPA8的結合，也無法降低HIF1α蛋白水平、抑制其下游BNIP3的表達、恢復GPX4水平、改善細胞活力或減輕心肌損傷和炎癥。這些結果證明，H₂S通過促進HSPA8在Cys574位點的硫水化，增強了其與HIF1α的相互作用，從而促進了HIF1α的降解，這是H₂S發揮心臟保護作用的核心分子機制。

研究評估了天然化合物大蒜素（Allicin）的作用。Allicin處理能有效恢復LPS刺激導致的心肌細胞內H₂S含量下降。同時，Allicin能上調GPX4蛋白表達，降低細胞內Fe²⁺和MDA水平，提高細胞活力，并減少LDH、CK-MB和cTn-l等心肌損傷標志物的釋放。這些結果表明，Allicin作為一種內源性H₂S供體，能夠模擬外源性H₂S供體的保護作用，通過抑制鐵死亡來減輕膿毒癥心肌損傷。

本研究系統闡明了H₂S在膿毒癥心肌損傷中的保護作用及其全新機制：H₂S通過促進分子伴侶HSPA8在Cys574位點的硫水化修飾，增強其與轉錄因子HIF1α的相互作用，從而促進HIF1α的降解；HIF1α水平的下降導致其下游靶基因BNIP3的表達抑制，最終阻斷了鐵死亡的發生，緩解了心肌損傷和炎癥反應。這一“H₂S–HSPA8–HIF1α–BNIP3–鐵死亡”軸為理解SIMI的發病機制提供了新的視角。研究還首次發現天然產物大蒜素（Allicin）能有效恢復內源性H₂S水平，并通過上述機制發揮心臟保護作用，且安全性高，具有顯著的轉化醫學潛力。本研究不僅深化了對H₂S蛋白質翻譯后修飾功能的認識，也為開發靶向該通路治療膿毒癥心肌病的新策略奠定了堅實的實驗基礎。

本研究存在一些局限性。首先，GYY4137和大蒜素的體內藥代動力學、最佳劑量及長期安全性有待進一步評估。其次，研究主要聚焦于HIF1α/BNIP3/鐵死亡軸，膿毒癥心肌功能障礙中涉及的其他信號通路和細胞類型未充分探索。第三，盡管證實了HSPA8硫水化的作用，但H₂S修飾的下游分子事件及潛在脫靶效應需進一步闡明。第四，本研究揭示了HSPA8-Cys574硫水化與HIF1α蛋白水平下降相關，但其精確的分子機制（如是否通過促進泛素化-蛋白酶體降解途徑）有待未來實驗驗證。第五，本研究的設計與我們之前發表的關于腎臟的研究是平行驗證，雖在核心指標和動物模型上保持一致，但缺乏直接的跨器官比較數據。

綜上所述，本研究發現CSE/H₂S通路的功能障礙通過促進HIF1α驅動的鐵死亡和炎癥，在SIMI的發病機制中起著關鍵作用。重要的是，我們鑒定出天然H₂S供體大蒜素（Allicin）是一種能有效恢復內源性H₂S水平、抑制鐵死亡、并在膿毒癥體內外模型中減輕心肌損傷的藥物。從機制上講，Allicin和外源性H₂S供體（如GYY4137）通過硫水化修飾HSPA8蛋白的Cys574位點發揮保護作用，從而促進HIF1α降解并抑制下游BNIP3介導的鐵死亡和線粒體功能障礙。這些結果不僅拓展了我們對膿毒癥心肌病氧化還原調控機制的理解，也凸顯了靶向CSE/H₂S–HSPA8–HIF1α軸的轉化潛力。作為一種臨床可及、天然來源的化合物，Allicin為預防和治療膿毒癥誘導的心功能不全提供了有前景的治療策略，值得在臨床環境中進一步研究。