家蠶，作為著名的經濟昆蟲和鱗翅目模式生物，其健康的維系是絲綢產業發展的基礎。然而，在其養殖過程中，病害是影響蠶絲產量的主要威脅之一。特別是由真菌（如微孢子蟲Nosema bombycis， N.b）和病毒（如家蠶核型多角體病毒Bombyx mori nucleopolyhedrovirus， BmNPV）引發的感染常常并發，給疾病防控帶來了巨大挑戰。昆蟲的中腸是消化吸收營養的核心器官，也是抵御病原入侵的第一道防線。要想有效控制疾病，我們必須深入了解中腸這個“前線陣地”的“兵力部署”和“防御戰術”——即不同細胞類型的功能，以及它們在遭遇不同病原入侵時如何協同或特異性地響應。然而，長期以來，家蠶中腸的細胞構成如同一幅尚未完成的拼圖，許多細胞類型缺乏明確的分子標記，導致我們對其功能多樣性和免疫響應模式的認識存在大片空白。針對這些關鍵問題，西南大學的研究團隊在《Journal of Advanced Research》上發表了一項研究，利用前沿的單核RNA測序技術，首次繪制了家蠶中腸的高分辨率單細胞圖譜，并系統揭示了中腸細胞在應對真菌和病毒共感染時的復雜應答網絡，為尋找跨病原的廣譜抗病靶點開辟了新途徑。

為了完成這項研究，研究人員主要運用了以下幾項關鍵技術方法：首先，采用單核RNA測序技術對家蠶中腸組織進行了高分辨率的細胞轉錄組分析。其次，利用熒光原位雜交技術對關鍵細胞簇的標記基因進行了定位驗證。第三，通過基因功能缺失實驗，利用小干擾RNA在個體水平敲低了篩選出的候選基因，并利用定量PCR檢測其對病原增殖的影響。研究中使用的家蠶樣本為西南大學家蠶基因資源庫保存的“大造”品系五齡幼蟲，并通過口服方式分別感染了N.b和BmNPV兩種病原體。

研究人員選取五齡家蠶幼蟲，分別在感染N.b或BmNPV后的24小時（感染早期）和96小時（感染后期）采集中腸組織，進行單核RNA測序。通過分析，共獲得了70,852個細胞核，并降維聚類為20個細胞簇。通過分析細胞簇在不同樣本中的比例，發現C4、C13等細胞簇在病原感染后比例顯著變化，提示它們可能與病原感染過程密切相關。

研究人員結合已知標記基因表達、KEGG/GO通路富集分析和偽時序分析，對20個細胞簇進行了系統注釋。最終將家蠶中腸細胞鑒定為五大類型：腸上皮細胞（占比54.4%），包括C1、C2、C4、C6、C10、C16以及EC樣細胞C0和C12；杯狀細胞（占比25.9%），包括C5、C8、C9、C11和C17；腸內分泌細胞（占比10.6%），主要為C3；腸道干細胞（占比2.17%），包括C13、C14、C15和C19；以及肌細胞（占比7.0%），包括C7和C18。同時，鑒定出杯狀細胞的一個新的代表性標記基因Cel。

利用熒光原位雜交技術，研究人員驗證了C0、C3、C12等細胞簇的標記基因表達位置，結果與細胞注釋的形態學特征相符。合并同類型細胞后，清晰地展示了家蠶中腸各類細胞的組成比例。

通過分析各細胞簇內的病原載量（即病原RNA reads占總RNA reads的比例），研究人員發現，在N.b感染后期，幾乎所有細胞簇都能檢測到N.b RNA，其中C4的病原載量和高度感染細胞比例最高，C10和C13次之。在BmNPV感染早期和后期，C13始終是病原載量最高的細胞簇，其次是C4和C15。綜合分析表明，C4和C13是兩種病原共有的核心易感細胞簇。

聚焦于易感細胞簇C13，研究人員篩選出在兩種病原感染后均特異性上調或下調的基因。通過KEGG富集分析和差異倍數篩選，確定了Ror、GNRHR、BMSK0008086和NT5E等候選基因。隨后的個體水平基因敲低實驗表明，敲低這些基因會影響BmNPV和N.b關鍵基因的表達，證實它們能調控病原的增殖。

研究人員分析了不同細胞類型在病原感染后的變化。發現感染后，ECs（特別是C4）的比例顯著增加。同時，不同細胞簇的免疫應答模式各異：大多數ECs（如C1、C4、C6、C10）免疫相關基因表達水平低，對病原入侵響應弱，病原載量高；而C2和C16雖同為ECs，卻表現為低病原載量、高免疫應答，其差異表達基因分別富集于凋亡、免疫效應以及Toll/IMD信號通路等，被定義為“低感染性細胞簇”；ECs樣細胞（C0、C12）和EEs（C3）則高表達先天免疫通路基因。此外，處于分化狀態的ISC（C13）在感染后免疫炎癥相關基因表達發生顯著改變。

基于以上結果，研究團隊提出了一個動態響應模型：病原（尤其是BmNPV）感染導致易感的ECs死亡，這會觸發ISCs（如C15）加速分化為新的ECs（如C13，進而分化為C4等），以維持中腸組織的完整性，但這同時可能為病原提供了更多可感染的靶細胞，形成了感染與修復并存的復雜局面。

本研究成功構建并精細注釋了家蠶中腸的單細胞圖譜，明確了五大細胞類型的組成與功能特征，并發現了新的GCs標記基因Cel。研究首次系統性鑒定了家蠶中腸內對真菌和病毒共感染響應的四類關鍵細胞簇：易感細胞簇C4和C13，以及低感染性細胞簇C2和C16。通過在易感細胞簇C13和低感染性細胞簇C2、C16中篩選并初步驗證了一批能同時影響N.b和BmNPV增殖的關鍵宿主基因，為開發針對多種家蠶病害的廣譜防控策略提供了潛在的分子靶點。

討論部分指出，與果蠅、埃及伊蚊等昆蟲相比，家蠶中腸ECs此前因標記基因缺乏而被嚴重低估，本研究將其比例修正至54.4%，更符合其作為主要功能細胞的生物學實際。研究揭示了ECs內部的高度異質性，部分ECs易感而部分（C2、C16）則具有較強的免疫防御能力。ISCs在感染過程中的增殖與分化，不僅參與了組織修復，也可能在病原傳播中扮演了角色。該研究采用的“剔除在其他細胞簇中同步變化的基因”的篩選策略，能更精準地鎖定特定細胞簇在感染中的關鍵基因，為利用單細胞測序數據進行靶點挖掘提供了有效方法。盡管個體水平的基因敲低實驗初步驗證了基因功能，但未來需要在特定細胞簇水平進行更精細的功能研究，以克服組織異質性帶來的挑戰。總之，這項研究不僅深化了對家蠶中腸生物學和免疫學的理解，也為利用多組學技術解析宿主-病原互作、篩選跨病原抗病靶標樹立了范例，具有重要的理論價值和農業應用前景。