《Transboundary and Emerging Diseases》：Emergence of a Highly Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) G2c Subtype in China: Isolation, Genetic and Pathogenic Characterization, and Cross-Neutralizing Antibody Response
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本文系統報道了中國高致病性豬流行性腹瀉病毒（PEDV）G2c亞型（代表毒株AHCZ02）的首次分離及其全面的生物學特征解析。研究通過流行病學調查（2021-2024年）、系統發育分析、結構建模、交叉中和試驗及仔豬攻毒實驗，揭示了G2c已成為當前中國流行的優勢毒株，其刺突（S）蛋白的關鍵氨基酸突變（N139D, I287M, F345L, L998M）導致了構象改變，這可能削弱了現有商品化疫苗的保護效力。研究發現，基于G2c毒株的田間反饋暴露免疫策略所誘導的中和抗體幾何平均滴度（GMT）顯著高于傳統疫苗。該研究為理解PEDV的進化動態、評估現有免疫策略的局限性以及開發針對流行毒株的下一代疫苗提供了關鍵科學依據。
引言
豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于α冠狀病毒屬。PEDV感染可導致豬只，特別是新生仔豬，發生嘔吐、嚴重水樣腹瀉和脫水，死亡率可高達100%，對全球養豬業構成重大經濟威脅。PEDV的刺突（Spike, S）蛋白是主要的表面抗原，含有主要的中和表位，介導病毒與宿主受體的結合及膜融合過程，是疫苗誘導免疫的關鍵靶標。
在自然選擇壓力下，PEDV不斷發生變異，形成了不同的基因型。根據S基因系統發育分析，PEDV毒株可分為三個主要基因型：經典G1型、流行G2型和重組S-INDEL型。其中，G2型進一步分為G2a、G2b和新興的G2c亞型。盡管G2型毒株傳統上與高毒力相關，但近年來的監測發現，G2c亞型已取代之前的變異株，成為中國豬群中的優勢流行毒株，這凸顯了對PEDV進化動態進行持續監測的必要性。
疫苗接種是控制PED的主要手段。然而，即使在嚴格執行疫苗免疫程序的豬場，PEDV疫情仍時有發生。這表明，基于G1a、G1b和G2b亞型的商品化疫苗對當前流行的G2c毒株的交叉保護效力正在下降。因此，豬場越來越多地采用可控的反饋免疫策略，即有意讓妊娠母豬暴露于本場的特定病原，以增強經乳傳遞的母源免疫力。
為應對能夠逃避現有免疫力的遺傳變異PEDV毒株的出現，本研究對當前流行的G2c亞型毒株進行了全面表征，旨在闡明其抗原性和致病性的變化。通過整合流行病學監測、病毒分離、系統發育分析、結構建模、交叉中和試驗和致病性評估，本研究旨在揭示中國當前流行的優勢PEDV毒株，闡明新興G2c變異株S糖蛋白的特征性氨基酸突變，模擬S蛋白的結構變化，比較田間暴露與傳統疫苗誘導的交叉中和抗體幾何平均滴度（GMT），并評估代表性G2c毒株（AHCZ02）在新生仔豬攻擊模型中的毒力。
材料與方法
本研究遵循安徽科技大學生物倫理委員會的批準進行。臨床樣本（直腸拭子和腸道組織）采集自2021年至2024年中國九個省份出現急性腹瀉的豬只。通過逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）對樣本進行PEDV檢測，并對陽性樣本的S基因進行擴增和測序，共獲得69條完整的S基因序列。
利用Vero E6細胞從2022年安徽省一次疫情暴發的新生腹瀉仔豬樣本中成功分離出一株PEDV毒株，命名為AHCZ02。通過間接免疫熒光試驗（IFA）和病毒一步生長曲線對分離毒株進行了鑒定和復制動力學分析。此外，對AHCZ02毒株進行了全基因組測序。
使用最大似然法對S基因和全基因組序列構建了系統發育樹。通過多序列比對，識別了G1、G2a、G2b、G2c和S-INDEL各亞型的S蛋白共有氨基酸序列及其差異。利用SWISS-MODEL服務器，以Pintung 52毒株（PDB: 7W6M）為模板，對G2a、G2b、G2c、S-INDEL亞型及AHCZ02毒株的S蛋白進行了同源建模，以分析關鍵突變對蛋白質三維結構的影響。
為評估針對G2c毒株的中和抗體反應，收集了來自六個商品豬場的118份血清樣本，并根據反饋暴露和免疫策略分為六組。使用AHCZ02毒株進行了病毒中和試驗，測定各組血清的中和抗體幾何平均滴度。
為評估AHCZ02毒株的致病性，選取十頭3日齡健康長白仔豬，隨機分為對照組和攻毒組。攻毒組仔豬經口接種AHCZ02毒株，對照組接種維持培養基。攻毒后，定期監測仔豬的臨床狀況、糞便評分、存活率和體重變化。實驗結束時，對所有仔豬進行剖檢，收集腸道組織進行組織病理學檢查和免疫組織化學（IHC）分析，以評估病理損傷和病毒抗原分布。
結果
PEDV AHCZ02毒株的分離與鑒定
PEDV AHCZ02毒株分離自2022年安徽省一次腹瀉疫情的新生仔豬。該毒株在Vero E6細胞中傳代至第9代時，在感染后24小時可誘導明顯的合胞體形成等細胞病變效應。IFA結果顯示，感染細胞胞漿內存在PEDV核衣殼蛋白的特異性熒光信號。一步生長曲線分析表明，AHCZ02毒株在感染后30小時達到復制峰值，滴度為106.64TCID50/0.1 mL，顯示出較強的細胞適應性和復制能力。
2021-2024年中國PEDV的流行病學
對2021年至2024年采集的樣本進行分析發現，在獲得的69條S基因序列中，G2型毒株占主導地位（92.75%）。其中，G2c亞型占比高達69.57%（48/69），而G2a和G2b亞型分別占20.29%和2.89%，S-INDEL型占7.25%。這一結果確證了G2c亞型是當前中國PEDV流行的絕對優勢毒株。
PEDV AHCZ02毒株的基因組特征
對AHCZ02毒株的全基因組測序分析顯示，其基因組長度為28,179個核苷酸，具有典型的冠狀病毒基因組結構。全基因組系統發育分析進一步確認AHCZ02屬于G2c進化分支。同源性比較顯示，AHCZ02與G2c參考毒株在主要結構蛋白編碼區（如S、M、N基因）具有極高的核苷酸一致性。
PEDV S蛋白的氨基酸特征分析
通過比較各亞型S蛋白的共有氨基酸序列，本研究在G2c亞型（包括AHCZ02）中鑒定出5個區別于G2a/G2b亞型的特征性氨基酸替換：N139D、Y182H、I287M、F345L和L998M。值得注意的是，N139D和I287M替換是G2c亞型特有的，而Y182H、F345L和L998M替換則是G2c與S-INDEL型共有，但與G2a/G2b型不同。
S蛋白結構分析
PEDV的S蛋白包含S1和S2兩個亞基，以及信號肽、N末端結構域、融合肽等多個功能域。三維結構同源建模和比較分析表明，上述5個突變中的4個（N139D、I287M、F345L和L998M）會導致S蛋白局部構象發生改變。例如，N139D突變導致其附近區域發生無規卷曲向α-螺旋的轉變及β-折疊的縮短；I287M和F345L突變分別引起N末端結構域內β-折疊的縮短和消失；L998M突變則導致S2亞基中α-螺旋的延長。值得注意的是，I287M和L998M兩個位點位于S1/S2亞基交界處的三維空間結構中，這些構象變化可能影響抗體的識別與結合。
針對流行性PEDV G2c毒株的中和效力
病毒中和試驗結果顯示，不同免疫策略誘導的中和抗體水平存在顯著差異。采用G2c毒株反饋暴露并結合滅活疫苗加強免疫的豬群，其中和抗體幾何平均滴度最高（GMT = 1893）。采用S-INDEL毒株反饋暴露并加強免疫的豬群，GMT為480。而僅使用傳統疫苗（基于AJ1102/G2b或CV777/G1a毒株）免疫的豬群，其中和抗體GMT顯著較低，分別為40、20和10。未免疫對照組的GMT低于檢測下限。
結果表明，G2c反饋暴露組誘導的中和抗體水平是S-INDEL反饋暴露組的3.9倍，證實了不同亞型間存在抗原性差異。更重要的是，所有反饋暴露組（GMT在480-1893之間）誘導的中和抗體水平，是傳統疫苗免疫組（GMT在10-40之間）的12倍至189.3倍。這凸顯了當前商品化疫苗對占主導地位的G2c變異株的保護效力嚴重不足。
PEDV AHCZ02毒株的致病性評估
經口接種AHCZ02毒株的3日齡仔豬在感染后24小時內全部出現急性水樣腹瀉、嘔吐等典型臨床癥狀。所有攻毒仔豬在感染后66小時內全部死亡，死亡率達100%。攻毒仔豬體重在感染后48小時內下降超過18%。剖檢可見小腸壁變薄、透明、充氣，腸腔內積聚黃色液體。組織病理學檢查顯示，攻毒仔豬的十二指腸、空腸、回腸和結腸均出現嚴重的絨毛萎縮。免疫組化分析證實，PEDV核衣殼抗原主要分布在空腸和回腸的絨毛上皮細胞內。這些結果綜合表明，AHCZ02毒株對新生仔豬具有高度致病性。
討論
本研究成功分離并全面表征了中國新出現的PEDV G2c亞型代表毒株AHCZ02。流行病學數據證實G2c已成為當前中國的絕對優勢流行毒株，與多項獨立研究結果一致。AHCZ02毒株在細胞中展現出了高效的復制能力，其病毒滴度達到106.64TCID50/0.1 mL，這可能與其在豬群中的流行優勢相關。
研究發現G2c亞型S蛋白存在5個特征性氨基酸突變。其中，N139D突變位于已知的中和表位S10區域內，F345L突變靠近N末端結構域的潛在受體結合界面。三維結構建模揭示，這些突變（特別是N139D, I287M, F345L, L998M）可引起S蛋白關鍵區域的構象變化，這可能是導致基于舊毒株（如G1a CV777, G2b AJ1102）的疫苗所誘導的抗體對G2c毒株中和能力大幅下降的結構基礎。
中和試驗數據為這一推斷提供了直接證據。傳統疫苗免疫豬群的血清對G2c毒株AHCZ02的中和能力極其有限（GMT 10-40），遠低于公認的與臨床保護相關的閾值（GMT 377-774）。相反，采用同型（G2c）或近似型（S-INDEL）毒株進行反饋暴露免疫的豬群，其中和抗體水平（GMT 480-1893）則顯著高于保護閾值。這從免疫學角度解釋了為何在嚴格執行傳統疫苗免疫的豬場，PEDV（尤其是G2c毒株）疫情仍會頻繁暴發，而反饋免疫策略在實踐中往往表現出更好的防控效果。
動物試驗進一步證實了AHCZ02毒株的高致病性，感染新生仔豬后導致100%的死亡率及典型的嚴重腸道病理損傷，其特征與其他報道的高致病性G2c毒株相似。
結論
綜上所述，本研究的流行病學調查揭示了G2c亞型是中國當前PEDV流行的絕對優勢毒株。成功分離的AHCZ02毒株具有高度的細胞適應性和對新生仔豬的強致病性。其S蛋白上鑒定出的多個特征性突變可能導致蛋白質構象改變，進而影響抗原性。最關鍵的是，現有的商品化疫苗對當前流行的G2c毒株誘導的中和抗體反應嚴重不足。這些發現不僅為理解PEDV G2c亞型的分子特征和進化提供了重要見解，更強調了針對當前流行毒株開發匹配疫苗的緊迫性，并為下一代PEDV疫苗的設計提供了關鍵的抗原靶點信息。持續加強病毒學監測對于有效跟蹤和應對PEDV的進化動態至關重要。
