當(dāng)細(xì)菌入侵人體，免疫系統(tǒng)會拉響警報，引發(fā)一場旨在清除病原體的“炎癥風(fēng)暴”。然而，這場風(fēng)暴如果失控，過量的促炎細(xì)胞因子不僅無法有效御敵，反而會“誤傷”自身組織，導(dǎo)致膿毒癥、牙髓炎等諸多疾病。因此，探尋炎癥信號被過度放大的“幕后推手”，是控制炎癥相關(guān)疾病的關(guān)鍵。近年來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，信使RNA (mRNA)上攜帶的化學(xué)修飾，如同給遺傳密碼貼上了“便利貼”，能精細(xì)調(diào)控基因的表達(dá)，這一領(lǐng)域被稱為“表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)”。在眾多修飾中，N6-甲基腺苷(m⁶A)的研究已較為深入，而另一種古老卻神秘的修飾——5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, m⁵C)在炎癥中的作用，仍是一片亟待探索的“未知海域”。

為了填補這一空白，來自武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊將目光投向了催化mRNA上m⁵C修飾的核心“作家”——NSUN2。他們想知道，在細(xì)菌感染引發(fā)的炎癥中，NSUN2是否扮演了重要角色？它是如何工作的？這項研究成果最終發(fā)表于《Journal of Biological Chemistry》。

為了解答這些問題，研究人員運用了多種關(guān)鍵技術(shù)。他們利用公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GEO)的生物信息學(xué)分析，篩選炎癥中變化的m⁵C相關(guān)基因。在動物模型上，他們通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Nsun2基因敲除小鼠，并分別建立了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的全身性炎癥模型和牙齒 pulp 暴露誘導(dǎo)的局部牙髓炎模型，以評估Nsun2缺失對炎癥表型的影響。在細(xì)胞水平，他們以人牙髓細(xì)胞(DPCs)為體外炎癥模型，通過過表達(dá)、RNA干擾(siRNA)技術(shù)操縱NSUN2和YBX1的表達(dá)，結(jié)合蛋白質(zhì)印跡(Western blot)、實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)等技術(shù)分析基因表達(dá)變化。為了直接驗證NSUN2對特定mRNA的修飾作用，他們采用了亞硫酸氫鹽處理結(jié)合桑格測序的技術(shù)，精準(zhǔn)定位了IL1B mRNA上的m⁵C修飾位點。此外，RNA免疫共沉淀(RIP)、m⁵C-RIP、RNA穩(wěn)定性測定以及免疫組織化學(xué)(IHC)等技術(shù)也被用于探究蛋白質(zhì)-RNA相互作用、修飾水平及mRNA半衰期。研究中還使用了臨床收集的正常與炎癥牙髓組織樣本進(jìn)行驗證。

研究人員發(fā)現(xiàn)，LPS處理會導(dǎo)致小鼠肺組織總RNA中m⁵C豐度全局性升高，并且m⁵C甲基轉(zhuǎn)移酶Nsun2的表達(dá)顯著上調(diào)。為了深入評估NSUN2的功能，他們構(gòu)建了Nsun2雜合子敲除(Nsun2^+/-)小鼠。在LPS誘導(dǎo)的全身性炎癥模型中，與野生型對照相比，Nsun2^+/-小鼠表現(xiàn)出更輕微的體重下降、更低的臨床評分以及更輕的肺組織損傷。同時，肺組織中促炎細(xì)胞因子(Il1b, Il6)和趨化因子(Cxcl10, Ccl2)的mRNA水平在LPS誘導(dǎo)后的上調(diào)也被Nsun2缺陷有效抑制。這些結(jié)果提示，NSUN2在系統(tǒng)性炎癥中起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。

在局部炎癥模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)LPS處理同樣會提升人牙髓細(xì)胞(DPCs)中RNA的m⁵C豐度及NSUN2的表達(dá)。對臨床牙髓炎樣本的分析顯示，無論是蛋白水平還是mRNA水平，NSUN2在炎癥牙髓中的表達(dá)均顯著高于正常牙髓。通過在Nsun2^+/-和野生型小鼠中建立實驗性牙髓炎模型，他們觀察到Nsun2缺陷能顯著減輕牙髓組織在細(xì)菌暴露12小時后的炎癥細(xì)胞浸潤和組織破壞。這表明NSUN2在牙髓炎的發(fā)生發(fā)展中同樣扮演了“助推器”的角色。

為了在細(xì)胞層面驗證NSUN2的促炎功能，研究人員在DPCs中進(jìn)行了基因操縱實驗。結(jié)果表明，單純過表達(dá)NSUN2就足以顯著上調(diào)IL1B、IL6、CXCL10和CCL2的mRNA表達(dá)。而當(dāng)NSUN2過表達(dá)與LPS處理聯(lián)用時，對這些因子表達(dá)的誘導(dǎo)作用進(jìn)一步增強；反之，敲低NSUN2則能削弱LPS的誘導(dǎo)能力。這證明LPS誘導(dǎo)的這些關(guān)鍵炎性因子表達(dá)，至少部分依賴于NSUN2。

機制探索是本研究的核心。研究人員首先確認(rèn)NSUN2確實負(fù)責(zé)DPCs中RNA的m⁵C修飾。接著，他們通過亞硫酸氫鹽處理結(jié)合單克隆測序，在IL1B mRNA的3'非翻譯區(qū)(3' UTR)發(fā)現(xiàn)了一個特異的m⁵C修飾位點，位于終止密碼子后的第86個胞嘧啶(C86)。NSUN2過表達(dá)能增加該位點的甲基化頻率。功能實驗表明，將該位點突變會導(dǎo)致報告基因mRNA的表達(dá)量和穩(wěn)定性顯著下降。更重要的是，過表達(dá)具有催化活性的野生型NSUN2能上調(diào)IL1B mRNA，而過表達(dá)催化失活的雙突變體(NSUN2-DM)則無此效果。NSUN2敲低會顯著減少IL1B mRNA上的m⁵C富集，并加速其降解。這些證據(jù)鏈清晰地表明，NSUN2通過催化IL1B mRNA特定位點的m⁵C修飾來維持其穩(wěn)定性，進(jìn)而提升其表達(dá)水平。

RNA修飾的功能需要“閱讀器”來識別和執(zhí)行。在三種已知的哺乳動物m⁵C閱讀器中，研究人員發(fā)現(xiàn)YBX1在LPS處理的DPCs以及臨床牙髓炎樣本中表達(dá)顯著上調(diào)。功能上，過表達(dá)YBX1能促進(jìn)IL1B等炎性因子的表達(dá)，而敲低YBX1則會抑制LPS的誘導(dǎo)作用，證明YBX1也參與了炎癥的正向調(diào)控。

進(jìn)一步的機制耦合顯示，YBX1蛋白能夠與IL1B mRNA結(jié)合，而這種結(jié)合依賴于上述C86位點的m⁵C修飾。突變該位點會嚴(yán)重削弱YBX1與IL1B mRNA的結(jié)合能力。與NSUN2類似，敲低YBX1也會加速IL1B mRNA的衰變。協(xié)同實驗表明，NSUN2過表達(dá)對炎性因子表達(dá)的促進(jìn)作用，會被同時敲低YBX1所抵消。并且，NSUN2的缺失會 dramatically 減少YBX1與IL1B mRNA的結(jié)合。這些結(jié)果共同揭示了一個完整的調(diào)控軸：NSUN2作為“作家”，在IL1B mRNA上打下m⁵C“標(biāo)記”；YBX1作為“閱讀器”，識別這一標(biāo)記并與之結(jié)合，從而穩(wěn)定IL1B mRNA，防止其被快速降解。

本研究首次系統(tǒng)揭示了RNA m⁵C修飾在細(xì)菌感染相關(guān)炎癥中的關(guān)鍵作用。研究人員通過體內(nèi)外模型證明，m⁵C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2在牙髓炎及全身性炎癥中表達(dá)上調(diào)，其缺失能顯著緩解炎癥損傷。在分子機制上，他們發(fā)現(xiàn)并驗證了NSUN2催化核心促炎細(xì)胞因子IL1B mRNA特定位點(C86)的m⁵C修飾。這種修飾被閱讀器YBX1特異性識別，兩者協(xié)同作用，通過增強IL1B mRNA的穩(wěn)定性來促進(jìn)其表達(dá)，從而驅(qū)動炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

這項研究的科學(xué)意義重大。它將表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的前沿領(lǐng)域與經(jīng)典的炎癥病理學(xué)聯(lián)系起來，揭示了NSUN2/YBX1-IL1B軸這一全新的炎癥調(diào)控通路，豐富了對炎癥發(fā)生發(fā)展分子網(wǎng)絡(luò)的理解。從轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)角度看，該研究為炎癥性疾病的治療提供了新的潛在靶點。相較于直接靶向細(xì)胞因子本身可能帶來的免疫抑制風(fēng)險，干預(yù)上游可逆的RNA修飾過程（如抑制NSUN2的活性）可能提供一種更精細(xì)、更安全的調(diào)控策略，為未來開發(fā)治療牙髓炎、膿毒癥等疾病的新療法奠定了理論基礎(chǔ)。