骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是兒童和青少年中最常見的原發性惡性骨腫瘤，局部患者的5年總生存率約為60%，但對于發生轉移或復發的患者，其5年生存率則低于20%，目前缺乏有效的靶向治療方法。因此，闡明驅動骨肉瘤進展的分子機制，對于開發新的治療策略至關重要。整合素β樣1（Integrin subunit beta-like 1, ITGBL1）是一種與整合素β亞基N端EGF樣結構域高度同源的胞外基質蛋白，在多種癌癥中異常表達并參與轉移調控，但其在骨肉瘤中的作用尚不清楚。熱休克蛋白90α家族B類成員1（Heat shock protein 90 alpha family class B1, HSP90AB1）是一種重要的分子伴侶，通過穩定多種客戶蛋白參與腫瘤發生發展。內質網（Endoplasmic reticulum, ER）是蛋白質合成、折疊和修飾的關鍵細胞器，壓力狀態下可引發內質網應激，進而誘導自噬，后者在癌癥中扮演著復雜的角色。本研究旨在揭示ITGBL1在骨肉瘤中的作用及其調控機制。

本研究首先檢測了ITGBL1在骨肉瘤中的表達。結果顯示，與人正常骨組織相比，ITGBL1在骨肉瘤組織中的mRNA和蛋白水平均顯著下調。對GEO數據庫（GSE33382和GSE19276）的分析也證實了ITGBL1 mRNA在骨肉瘤樣本中低表達。更重要的是，來自TARGET數據庫的RNA測序數據分析表明，與無轉移患者相比，發生肺轉移的骨肉瘤患者原發腫瘤中ITGBL1的轉錄水平顯著更低，這一結果在臨床樣本的免疫組化分析中得到了進一步驗證。生存分析顯示，ITGBL1低表達的骨肉瘤患者總生存期（OS）和無病生存期（DFS）均顯著縮短。這些結果表明，ITGBL1在骨肉瘤中表達下調，且其低表達與患者不良預后密切相關。

為了探究ITGBL1下調是否直接參與骨肉瘤進展，研究人員進行了功能缺失實驗。在143B和HOS細胞中敲低ITGBL1后，CCK-8實驗顯示細胞增殖能力顯著增強；劃痕愈合和Transwell實驗表明細胞的遷移和侵襲能力也明顯提升。此外，ITGBL1敲低還增強了骨肉瘤細胞的成球能力，上調了干性相關蛋白（OCT4、SOX2、NANOG）的表達，并增加了CD133陽性細胞的比例。同時，TUNEL實驗表明敲低ITGBL1顯著抑制了骨肉瘤細胞的凋亡。這些體外實驗結果在動物模型中得到了進一步證實：在裸鼠皮下成瘤實驗中，敲低ITGBL1顯著增強了143B細胞的致瘤能力；在原位骨肉瘤模型中，穩定敲低ITGBL1的143B細胞表現出更強的腫瘤生長優勢和更嚴重的骨破壞；腫瘤組織的免疫組化分析顯示，Ki67、OCT4、SOX2和NANOG的表達升高，而凋亡細胞減少。在尾靜脈注射建立的肺轉移模型中，敲低ITGBL1組的肺部熒光信號更強，肺轉移結節數量也更多。這些數據共同表明，ITGBL1的下調通過促進骨肉瘤細胞增殖、轉移、干性并抑制凋亡，強力驅動了骨肉瘤的進展。

鑒于ITGBL1下調促進骨肉瘤進展，研究人員推測其過表達可能抑制進展。體外實驗證實了這一推測：過表達ITGBL1顯著抑制了骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，同時抑制了細胞成球能力和干性相關蛋白表達，但促進了細胞凋亡。相應的體內實驗也顯示，過表達ITGBL1能顯著抑制原位移植瘤的生長和骨破壞，降低腫瘤中Ki67和干性標志物的表達，并增加凋亡細胞數量。此外，ITGBL1過表達也有效抑制了骨肉瘤細胞的肺轉移。這些結果確立了ITGBL1在骨肉瘤中的抑癌作用。

為了闡明ITGBL1抑制骨肉瘤進展的分子機制，研究人員對過表達ITGBL1的143B細胞進行了RNA測序。KEGG和GO富集分析顯示，ITGBL1的表達與內質網通路相關，GSEA進一步證實其與內質網應激正相關。透射電鏡觀察發現，過表達ITGBL1的細胞中內質網增厚。Western blot和RT-qPCR分析表明，ITGBL1正調控內質網應激相關蛋白（BIP、PERK、IRE1α、CHOP）的表達。共聚焦顯微鏡分析證實ITGBL1定位于內質網。鑒于內質網應激可誘導自噬，研究人員進一步檢測發現，過表達ITGBL1的細胞中自噬溶體形成增加，自噬標志蛋白LC3B表達上調而p62下調，轉染LC3B-GFP-mCherry質粒的熒光實驗也證實了自噬流的增強。由于活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）可誘導內質網應激，實驗發現ITGBL1過表達顯著增加了細胞內ROS水平，而ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）處理則能逆轉ITGBL1誘導的ROS升高、內質網應激和自激活。這些結果提示，ITGBL1至少部分通過上調ROS來激活骨肉瘤細胞中的內質網應激和自噬。

接下來，研究人員探究了ITGBL1是否通過激活內質網應激誘導的自噬來發揮抗癌作用。使用內質網應激抑制劑4-PBA處理細胞，發現其能顯著抑制ITGBL1誘導的內質網應激激活和自噬，并減弱ITGBL1對細胞增殖、轉移、干性的抑制及對凋亡的促進作用。在原位骨肉瘤模型和肺轉移模型中，4-PBA處理同樣逆轉了ITGBL1過表達對腫瘤生長、骨破壞、干性標志物表達的抑制以及對凋亡的促進作用。此外，抑制自噬也能減弱ITGBL1誘導的骨肉瘤生長抑制。這些發現表明，ITGBL1通過誘導內質網應激來刺激自噬，從而抑制骨肉瘤進展。

為了探究ITGBL1在骨肉瘤中下調的機制，研究人員通過免疫共沉淀聯合質譜分析（Co-IP/MS）尋找與ITGBL1互作的蛋白。在143B和HOS細胞中，通過比較抗FLAG組與抗IgG對照組的蛋白譜，篩選出15個潛在的ITGBL1互作蛋白候選。基于HSP90AB1在癌癥轉移、凋亡、干性和內質網自噬調控中的已知作用，研究者選擇其進行后續驗證。Co-IP實驗證實了內源性和外源性ITGBL1與HSP90AB1在骨肉瘤細胞中的相互作用，免疫熒光實驗也顯示二者在細胞內共定位。通過蛋白質-蛋白質對接分析和截短突變體構建，最終確定HSP90AB1的第233–620氨基酸區域（結構域II）和ITGBL1的第230–494氨基酸區域（結構域III-IV）是兩者結合所必需的。

研究人員進一步探究了HSP90AB1對ITGBL1表達的影響。Western blot顯示HSP90AB1負調控ITGBL1的蛋白水平，且呈劑量依賴性，但不影響其mRNA表達。蛋白酶體抑制劑MG132處理能抑制HSP90AB1誘導的ITGBL1降解，而蛋白質合成抑制劑CHX處理則加速了ITGBL1的降解，表明HSP90AB1通過蛋白酶體降解系統在翻譯后水平調控ITGBL1。泛素化實驗證實，過表達HSP90AB1增加了ITGBL1的泛素化，而抑制或敲低HSP90AB1則降低了其泛素化。通過轉染不同類型的泛素單體（K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63），發現HSP90AB1優先招募K63連接的泛素鏈來促進ITGBL1降解。此外，缺失關鍵結合區域（氨基酸233-620）的HSP90AB1突變體無法影響ITGBL1的泛素化和蛋白水平。這些數據表明，HSP90AB1通過與ITGBL1直接結合，通過刺激K63連接的多聚泛素化介導的降解來下調ITGBL1。

上述結果表明HSP90AB1負調控ITGBL1，暗示其可能抑制ITGBL1的抗癌作用。體外實驗發現，過表達HSP90AB1可抑制ITGBL1誘導的內質網擴張、內質網應激、自噬，并減弱ITGBL1對骨肉瘤細胞增殖、轉移、干性的抑制及對凋亡的促進作用。動物模型實驗進一步證實，過表達HSP90AB1能削弱ITGBL1對腫瘤生長、骨破壞、肺轉移的抑制效果，并抑制ITGBL1誘導的凋亡。重要的是，無法與ITGBL1結合的HSP90AB1突變體不能有效抵消ITGBL1的抑瘤作用，反之亦然，表明二者的相互作用在功能上至關重要。臨床樣本分析顯示，HSP90AB1在骨肉瘤組織和細胞系中表達顯著上調，且高表達與患者不良預后相關。免疫熒光染色分析骨肉瘤組織芯片發現，HSP90AB1的表達與ITGBL1和BIP的表達呈負相關，而ITGBL1與BIP的表達呈正相關。生存分析表明，在HSP90AB1高表達的骨肉瘤患者中，ITGBL1低表達者的生存率更低。這些數據表明，HSP90AB1通過與ITGBL1結合并下調其表達，從而削弱了ITGBL1在骨肉瘤中的腫瘤抑制功能。

上述發現提示，阻斷HSP90AB1與ITGBL1的相互作用可能恢復ITGBL1表達，從而抑制骨肉瘤進展。為此，研究者從ZINC數據庫的2115個FDA批準小分子化合物中進行虛擬篩選，以尋找能阻斷二者結合的小分子。篩選出四個候選分子，其中伊維菌素（Ivermectin）因其能結合在HSP90AB1與ITGBL1的界面且結合能最低而被選中用于后續實驗。體外實驗表明，伊維菌素處理不影響HSP90AB1的表達，但能上調ITGBL1蛋白水平，并抑制二者在骨肉瘤細胞中的相互作用。重要的是，伊維菌素處理能顯著抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移侵襲和干性，并促進細胞凋亡、內質網應激和自噬。敲低ITGBL1可大幅阻斷伊維菌素的這些抗骨肉瘤作用，表明伊維菌素主要通過ITGBL1發揮作用。動物模型實驗進一步證實了伊維菌素的療效：在原位骨肉瘤模型和肺轉移模型中，伊維菌素治療顯著抑制了腫瘤生長、骨破壞和肺轉移，上調了腫瘤中ITGBL1的表達并促進了細胞凋亡。這些結果表明，伊維菌素是一種能阻斷HSP90AB1與ITGBL1相互作用的小分子，對骨肉瘤的生長和轉移具有強效抑制作用。

本研究通過一系列體內外實驗和臨床樣本分析，證明HSP90AB1的異常高表達通過抑制ITGBL1/內質網應激/自噬軸來促進骨肉瘤進展。研究者首次報道了ITGBL1在骨肉瘤中異常低表達并發揮抑癌作用，其機制是通過上調ROS激活內質網應激及自噬。同時，揭示了HSP90AB1通過K63連接的多聚泛素化途徑降解ITGBL1這一導致其低表達的重要翻譯后調控機制。此外，研究還發現FDA已批準的抗寄生蟲藥伊維菌素能有效阻斷HSP90AB1與ITGBL1的相互作用，恢復ITGBL1的表達和功能，從而在體內外顯著抑制骨肉瘤進展。這項工作不僅闡明了一個新的促進骨肉瘤進展的分子機制（HSP90AB1/ITGBL1/ER Stress/Autophagy軸），還為骨肉瘤，特別是HSP90AB1高表達的骨肉瘤，提供了一種有前景的治療策略和候選藥物。