結直腸癌（CRC）是全球范圍內發病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，目前的臨床治療手段在防止復發和轉移方面效果有限，患者5年生存率改善甚微。近年來，靶向特定程序性細胞死亡通路（如凋亡、焦亡、鐵死亡）成為藥物研發熱點，但腫瘤耐藥性和微環境的影響限制了現有療法的效果。因此，探索新的腫瘤細胞死亡機制成為優先研究方向。

二硫下垂是一種新近發現的、區別于已知程序性細胞死亡形式的新型死亡方式。其典型特征是在高表達溶質載體家族7成員11（SLC7A11）的細胞中，葡萄糖饑餓條件下NADPH快速耗竭和細胞骨架蛋白中異常二硫鍵的形成，最終導致肌動蛋白網絡崩潰和細胞死亡。鑒于CRC細胞普遍存在SLC7A11表達異常和超高代謝表型，靶向二硫下垂通路為CRC治療提供了有前景的新策略。

本研究開發了一種由二硫鍵橋聯的雙核釕配合物RuSSRu。其在雙光子激發下產生的ROS可導致溶酶體損傷并啟動細胞逃逸機制。更重要的是，這一過程會觸發一系列代謝紊亂級聯反應，包括二硫鍵累積和ROS誘導的NADPH耗竭，最終導致細胞骨架崩塌和二硫下垂。二硫下垂與溶酶體損傷誘導的凋亡之間的協同作用，共同放大了腫瘤細胞死亡，為CRC治療揭示了一種新機制并提供了多功能治療策略平臺。

RuSSRu在400–600 nm范圍內具有寬吸收帶，在約600 nm處有發射峰。其在808 nm附近的雙光子吸收截面較大，達到156.86 GM，展現了出色的雙光子吸收特性，支持其通過雙光子光活化實現潛在抗腫瘤效應。

1O₂、O₂^?•和OH^?•的檢測結果比較。(h,i) RuSSRu在不同濃度下的Zeta電位和TEM圖像。">

詳細的評估表明，RuSSRu和其前體RuOH均能有效產生I型和II型ROS。在生理相關條件下，RuSSRu表現出優異的穩定性，在細胞培養基中孵育后，其原始色譜峰面積保留超過95%，表明其在細胞實驗條件下分子狀態穩定且分散良好。

1H NMR譜圖。">

共定位分析顯示，RuSSRu的紅色磷光與溶酶體探針LTDR的熒光完美重疊（皮爾遜共定位系數PCC=0.91），而與線粒體探針MTDR的共定位系數僅為0.14，表明RuSSRu主要富集于溶酶體。STED顯微成像進一步追蹤了光照后RuSSRu在溶酶體中的動態過程：隨著光照刺激，RuSSRu（紅色）與LTDR（偽綠色）的重疊區域（黃色）逐漸消失，兩者熒光開始分離，表明RuSSRu能夠逐步從溶酶體中逃逸。

考慮到RuSSRu的溶酶體靶向特性及其在光照下從溶酶體逃逸的能力，研究評估了RuSSRu對溶酶體功能的影響。通過AO染色評估溶酶體膜通透性（LMP），結果顯示，與對照組和黑暗條件相比，RuSSRu處理組的綠色熒光強度增加，表明LMP顯著升高。同時，通過評估組織蛋白酶D（CTSD）從溶酶體腔向細胞質的釋放，間接評估了溶酶體膜完整性。當RuSSRu受到激光刺激時，CTSD的釋放增加。值得注意的是，在此過程中，RuSSRu在黑暗條件下使CTSD活性降低約30%，在光照刺激下降低近60%。進一步評估溶酶體生物合成發現，調控溶酶體生物合成的關鍵轉錄因子TFEB的核轉位以及相關基因（Ctsb、Ctsd、Lamp1、Clcn7）的mRNA水平均未發生顯著改變。這些結果表明，RuSSRu可能損害溶酶體功能并增加溶酶體膜通透性，但對溶酶體生物合成沒有影響。

CCK8法測定細胞活力顯示，在光照下，RuSSRu呈現劑量依賴性抗腫瘤效應，24小時的IC₅₀值為2.19 μm，顯著高于黑暗條件下的IC₅₀值（8.18 μm）。其抗腫瘤活性在光照和黑暗條件下均顯著高于對照分子RuOH、[Ru(bpy)₃]Cl₂和SS。在人類結腸癌細胞系HCT116中也觀察到了類似的結果。

劃痕實驗結果表明，RuSSRu聯合光照處理組的細胞遷移速度慢于對照組。丙二醛（MDA）作為脂質過氧化的生物標志物，其表達在RuSSRu-光照處理組中增加，表明該組細胞具有更高的氧化應激水平。細胞克隆形成實驗證實，光活化的RuSSRu顯著抑制了克隆形成。蛋白質印跡分析凋亡相關蛋白顯示，RuSSRu有效誘導了細胞凋亡。具體而言，與對照組和黑暗條件相比，光照下的RuSSRu顯著上調了促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達，同時下調了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。Annexin V–PI染色結合流式細胞術分析進一步證實，RuOH和RuSSRu在光照下均能觸發高水平的凋亡，凋亡率超過90%。值得注意的是，盡管凋亡率相當，但在同等釕元素細胞攝取條件下，RuSSRu在消融腫瘤細胞方面表現出比RuOH顯著更高的效力，這表明除了凋亡之外，可能有其他機制增強了其治療效果。

為探索RuSSRu抗腫瘤效應背后的機制，研究聚焦于二硫鍵的作用。使用熒光染料修飾的鬼筆環肽評估F-肌動蛋白細胞骨架的完整性。與對照組和黑暗條件相比，RuSSRu在光照下孵育的細胞表現出顯著的細胞骨架破壞和崩塌。鬼筆環肽與DID標記的細胞膜共染色進一步顯示，在此過程中發生了F-肌動蛋白細胞骨架紊亂以及質膜皺縮或破裂。這些形態學改變在RuOH刺激的細胞中未觀察到。

能量代謝失調被確定為二硫下垂的另一個關鍵特征。由于RuSSRu產生的ROS可能與還原型NADPH發生氧化還原反應，導致其耗竭和失活，研究評估了各組細胞的NADPH和半胱氨酸水平。與預期一致，RuSSRu-光照處理組的游離NADPH和半胱氨酸水平相較于黑暗處理組顯著降低。此外，對葡萄糖代謝途徑的評估顯示，反映糖酵解的乳酸水平在RuSSRu-光照處理組相對于對照組顯著降低，表明過量的二硫鍵可能阻礙了糖酵解代謝途徑中關鍵酶的活性。相應地，當細胞受到RuSSRu聯合光照刺激時，ATP產量減少，這可歸因于糖代謝受損。同時，反映細胞內抗氧化能力的谷胱甘肽（GSH）含量在RuSSRu-光照處理組也顯著降低。這些變化符合二硫下垂的代謝特征。結合形態學改變，研究初步得出結論，RuSSRu誘導的二硫下垂促進了細胞死亡。

鑒于RuSSRu在體外表現出令人滿意的抗腫瘤功效，研究進一步探討了其在體內的治療效率。通過將MC38細胞皮下接種于小鼠左腋窩疏松結締組織構建荷瘤小鼠模型。考慮到CRC淺表腫瘤模型的特點，本研究采用了原位腫瘤注射方案。在28天的治療期間，各組小鼠體重未發生顯著變化。宏觀上，前14天各組腫瘤生長幾乎無變化，但在第二個14天治療后受到抑制。由于雙光子照射能顯著增強組織穿透性，在雙光子照射（808 nm, 40 mW cm^?2）10分鐘后，RuSSRu-光照組的腫瘤生長相對于對照組（空白）和順鉑/RuSSRu-黑暗組被明顯抑制。這些結果也通過體內熒光成像、腫瘤體積/質量的統計數據以及離體腫瘤圖像得到證實。

顯微層面，通過TUNEL染色檢測腫瘤組織中凋亡的腫瘤細胞。在治療組中，與順鉑/RuSSRu-黑暗組相比，RuSSRu+光照組的腫瘤細胞凋亡數量最多。H&E染色和Ki67免疫熒光染色進一步證明，與其他組相比，RuSSRu+光照組的腫瘤損傷更為嚴重。

為評估RuSSRu的生物安全性，研究在給藥期間和之后進行了全面的毒性評估。在28天的治療期間，各組均未發現明顯的體重下降。在主要器官（包括心、肝、肺、腎、脾）中未觀察到RuSSRu處理小鼠的顯著生理形態學改變，表明其在體循環中具有良好的生物安全性。此外，反映肝功能（AST和ALT）、腎功能（UREA和CREA）和心功能（CK-MB和LDH）的血清生化分析也未顯示明顯異常�？傮w而言，結果表明RuSSRu在MC38荷瘤小鼠中具有可忽略的全身毒性。

生物信息學分析顯示，有10個基因的表達與結腸癌患者的總生存期（OS）和無復發生存期（RFS）相關。當識別FDR閾值小于5%時，僅Filamin A (FLNA)和富含亮氨酸PPR基序蛋白（LRPPRC）的相關性顯著。FLNA被認為是正相關的風險因素（OR > 1），而LRPPRC是負相關的風險因素（OR < 1）。

為深入探索RuSSRu誘導結腸癌二硫下垂的具體機制，對來自不同組別的小鼠結腸腫瘤進行了全基因組RNA測序（RNA-seq）。與對照組相比，RuSSRu+光照組相關基因表達的下調和上調從差異基因聚類熱圖中清晰可見。在對二硫下垂相關基因進行分析后，隨后的熱圖分析顯示，對照組和RuSSRu-光照組之間LRPPRC的差異表達最為顯著。火山圖也顯示了兩個組之間mRNA表達上調和下調的基因。有趣的是，LRPPRC是通過取上述關鍵基因集與二硫下垂相關基因的交集而得到的�；�于KEGG通路和GO通路的富集分析進一步闡明了差異表達基因（DEGs）的潛在功能。

為了驗證LRPPRC介導的二硫下垂作用，我們在MC38細胞和小鼠腫瘤模型中檢測了不同條件下LRPPRC的mRNA和蛋白表達水平。免疫印跡和免疫熒光分析顯示，與對照組相比，RuSSRu+光照處理的細胞中LRPPRC表達顯著降低。一致地，LRPPRC的mRNA水平也顯示顯著下降。當結腸腫瘤接受RuSSRu聯合PDT治療時，LRPPRC同樣下調�？紤]到SLC7A11在二硫下垂中的重要作用，研究也觀察了其mRNA和蛋白水平的表達。這些結果表明，RuSSRu介導的二硫下垂可能受LRPPRC調控。

為了直接驗證LRPPRC是否在RuSSRu誘導的二硫下垂中起關鍵作用，使用了過表達質粒觀察LRPPRC的影響。首先研究了不同組別細胞活力和克隆形成能力的變化。由于LRPPRC可以正向調節細胞狀態，其過表達能顯著改善由二硫下垂誘導的細胞毒性。RuSSRu處理后，過表達LRPPRC的細胞數量和活力得到顯著改善。進一步評估了二硫下垂的標志物。與野生型細胞相比，過表達LRPPRC的細胞在RuSSRu處理時ATP水平更高。而作為腫瘤微環境中葡萄糖代謝關鍵指標的乳酸值也顯著增加。這表明，與野生型細胞相比，過表達LRPPRC的細胞在受到RuSSRu刺激后，糖代謝得到改善。因此，RuSSRu誘導的二硫下垂是由LRPPRC介導的。

本研究開發了一種雙核釕配合物RuSSRu，其能夠產生活性氧（ROS）誘導溶酶體損傷并氧化NADPH。當該復合物釋放到細胞質中后，其二硫鍵加劇了二硫脅迫，導致細胞骨架崩塌和葡萄糖代謝紊亂，最終觸發二硫下垂。這一機制與溶酶體損傷誘導的細胞凋亡相結合，協同加速了腫瘤細胞死亡。該方法在結直腸癌治療中展現出高效性和良好的生物安全性。因此，我們的工作通過同時誘導凋亡和二硫下垂，提出了一種創新的治療策略，以增強癌癥治療效果。