研究首先確認(rèn)了硫酸軟骨素蛋白聚糖4（CSPG4）是頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）的重要治療靶點(diǎn)。對癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)的分析顯示，CSPG4 mRNA在HNSCC腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常頭頸組織，且高表達(dá)CSPG4與患者較差的總生存期相關(guān)。在研究者自身的臨床隊(duì)列中，通過qPCR和免疫組化也驗(yàn)證了CSPG4在腫瘤組織中存在mRNA和蛋白水平的過表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CSPG4的高表達(dá)主要富集于預(yù)后更差的HPV陰性HNSCC亞型中。在體外，多個(gè)HNSCC細(xì)胞系也表現(xiàn)出顯著的CSPG4表達(dá)。此外，CSPG4的表達(dá)與癌癥干細(xì)胞（CSC）標(biāo)志物CD44呈正相關(guān)，共同免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)也證實(shí)了二者在患者組織和細(xì)胞系中的共表達(dá)，提示CSPG4可能是HNSCC中具有干細(xì)胞特性細(xì)胞群的一個(gè)標(biāo)志。

為探究CSPG4的功能，研究者在三個(gè)獨(dú)立的HNSCC細(xì)胞模型中利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了CSPG4基因。敲除成功消除了CSPG4的蛋白和細(xì)胞表面表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞體外增殖能力顯著下降，細(xì)胞周期G2-M期比例和增殖指數(shù)降低。雖然遷移和侵襲能力未受顯著影響，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，敲除CSPG4的細(xì)胞在小鼠體內(nèi)形成系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的能力減弱，延長了小鼠生存期。通過在敲除細(xì)胞中回補(bǔ)表達(dá)CSPG4，細(xì)胞的增殖能力和體內(nèi)成瘤性得以恢復(fù)，證實(shí)了CSPG4是驅(qū)動(dòng)HNSCC生長的關(guān)鍵因子。

研究進(jìn)一步構(gòu)建了CSPG4敲除、CD44敲低以及雙敲的等基因CNE-2細(xì)胞模型。功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)敲除CSPG4或敲低CD44均能抑制細(xì)胞增殖和克隆形成能力，而同時(shí)靶向兩者則產(chǎn)生協(xié)同抑制效應(yīng)。在腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)中，CD44敲低顯著損害了細(xì)胞的成球能力，而CSPG4與CD44雙敲則使損害進(jìn)一步加劇。此外，CD44敲低增強(qiáng)了細(xì)胞對順鉑的敏感性，而CSPG4敲除則使這種增敏作用更為顯著。這些結(jié)果表明，CSPG4與CD44在功能上協(xié)同作用，共同驅(qū)動(dòng)HNSCC的進(jìn)展、干性和治療抵抗。

對TCGA中HNSCC腫瘤的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，CSPG4高表達(dá)（CSPG4^high）的腫瘤富集了與增殖、轉(zhuǎn)移和干性相關(guān)的基因特征，而與凋亡相關(guān)的基因下調(diào)。在免疫特征方面，CSPG4^high腫瘤中免疫檢查點(diǎn)分子IGSF8、PD-L1和PD-L2的轉(zhuǎn)錄本水平顯著升高。利用CIBERSORT算法對腫瘤免疫細(xì)胞組成的反卷積分析顯示，CSPG4^high腫瘤中效應(yīng)免疫細(xì)胞（如初始B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞、活化記憶CD4⁺T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞和γδ T細(xì)胞）的浸潤減少，而靜息記憶CD4⁺T細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞以及M0和M1型巨噬細(xì)胞的比例增加。相關(guān)性分析進(jìn)一步證實(shí)CSPG4表達(dá)與CD8⁺T細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。利用腫瘤免疫功能障礙和排斥（TIDE）算法進(jìn)行評估，CSPG4^high腫瘤的TIDE評分顯著更高，預(yù)示著其對PD-1/PD-L1阻斷療法的反應(yīng)可能較差。這些發(fā)現(xiàn)表明，CSPG4^high的HNSCC具有免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境特征。

研究者構(gòu)建了基于鼠源單鏈可變區(qū)片段（scFv）763.74的CSPG4特異性嵌合抗原受體（CAR），并測試了不同的鉸鏈區(qū)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有包含突變IgG₄CH₂-CH₃（mIgG₄）鉸鏈（不結(jié)合Fcγ受體）的CAR-T細(xì)胞才能在靶細(xì)胞存在時(shí)特異性上調(diào)激活標(biāo)志CD69。基于此鉸鏈，研究者構(gòu)建了分別包含CD28或4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的CSPG4.CAR。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，兩種CAR-T細(xì)胞均能有效殺傷HNSCC靶細(xì)胞，但CD28結(jié)構(gòu)的CAR-T細(xì)胞在抗原刺激下分泌更高水平的IL-2和IFN-γ。在荷瘤小鼠模型中，兩種CAR-T細(xì)胞僅能適度延遲腫瘤進(jìn)展。然而，在靜息狀態(tài)下，兩種CSPG4.CAR-T細(xì)胞均自發(fā)分泌高水平的促炎細(xì)胞因子，并高表達(dá)激活標(biāo)志和耗竭標(biāo)志，表明其存在顯著的抗原非依賴性“強(qiáng)直信號”，這可能會限制其長期療效。

為降低免疫原性和強(qiáng)直信號，研究者將鼠源763.74 scFv的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）移植到一個(gè)經(jīng)過工程化改造、減少了表面正電荷殘基的人源抗體框架上，從而生成了人源化CSPG4.CAR（CSPG4^Hu.CAR）。結(jié)構(gòu)建模顯示，與野生型CAR（CSPG4^WT.CAR）相比，CSPG4^Hu.CAR的表面正電荷殘基和正靜電場顯著減少，計(jì)算出的最大正電荷斑塊（PCP）評分從89降至30。在Jurkat T細(xì)胞中，CSPG4^Hu.CAR在細(xì)胞膜上呈彌散分布，而CSPG4^WT.CAR則形成明顯的聚集簇。在原代人T細(xì)胞中，CSPG4^Hu.CAR-T細(xì)胞的基底CD3ζ ITAM磷酸化水平、激活標(biāo)志（CD69, CD25, ICOS）表達(dá)以及耗竭標(biāo)志（PD-1, LAG-3, TIM-3）表達(dá)均顯著低于CSPG4^WT.CAR-T細(xì)胞，其“強(qiáng)直信號指數(shù)”和“耗竭評分”也顯著降低。

功能上，CSPG4^Hu.CAR-T細(xì)胞在靜息時(shí)保持靜默，但在抗原刺激時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的響應(yīng)。它們能更高效地上調(diào)CD69，并展現(xiàn)出更強(qiáng)的抗原依賴性細(xì)胞毒性。在一個(gè)連續(xù)再刺激殺傷實(shí)驗(yàn)中，CSPG4^Hu.CAR-T細(xì)胞在五輪挑戰(zhàn)中均維持了更高的腫瘤裂解率和細(xì)胞因子（IFN-γ, IL-2, TNF-α）分泌能力，同時(shí)耗竭標(biāo)志表達(dá)更低，并保留了更高比例的干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞（T_scm）。

在CNE-2細(xì)胞系來源的異種移植小鼠模型中，CSPG4^Hu.CAR-T治療能誘導(dǎo)快速、持久的腫瘤消退，并顯著延長小鼠生存期，而CSPG4^WT.CAR-T僅產(chǎn)生短暫、有限的控制。在外周血和腫瘤微環(huán)境中，CSPG4^Hu.CAR-T細(xì)胞占比更高，PD-1表達(dá)更低，且中央記憶T細(xì)胞（T_cm）比例更高。在患者來源異種移植（PDX）模型中，CSPG4^Hu.CAR-T同樣能更強(qiáng)地抑制腫瘤生長并延長生存期。治療終點(diǎn)時(shí)，CAR-T治療組（尤其是CSPG4^Hu組）腫瘤組織的CSPG4免疫組化評分顯著降低，反映了抗原陽性腫瘤細(xì)胞被有效清除。

對CSPG4^WT和CSPG4^HuCAR-T細(xì)胞的RNA測序分析揭示了根本性的轉(zhuǎn)錄組差異。CSPG4^Hu細(xì)胞高表達(dá)與干性相關(guān)的基因（如TCF7, LEF1, SELL, IL7R），而CSPG4^WT細(xì)胞則富集了耗竭標(biāo)志（如LAG3, TIGIT, TOX, NR4A家族）和糖酵解相關(guān)酶。基因集富集分析（GSEA）顯示，CSPG4^Hu細(xì)胞中與增殖壓力（MYC靶標(biāo)、E2F靶標(biāo)）和代謝過度驅(qū)動(dòng)（氧化磷酸化、糖酵解）相關(guān)的通路被顯著抑制，而與T細(xì)胞分化、遷移和PI3K/Akt信號相關(guān)的通路被激活。這表明，人源化和電荷優(yōu)化將CAR-T細(xì)胞從強(qiáng)直信號誘導(dǎo)的耗竭和代謝過度激活狀態(tài)，重編程到了一個(gè)更具干性、記憶相關(guān)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這為其卓越的持久性提供了分子基礎(chǔ)。

這項(xiàng)研究系統(tǒng)性地驗(yàn)證了CSPG4作為HPV陰性HNSCC治療靶點(diǎn)的潛力，并創(chuàng)新性地通過人源化與電荷優(yōu)化CAR設(shè)計(jì)，解決了傳統(tǒng)鼠源scFv導(dǎo)致的強(qiáng)直信號和早期耗竭難題。優(yōu)化后的CSPG4^Hu.CAR-T細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄和代謝上被重編程，呈現(xiàn)出干細(xì)胞樣記憶表型，從而在多種HNSCC臨床前模型中實(shí)現(xiàn)了更強(qiáng)的持久性和抗腫瘤療效。該工作為推進(jìn)實(shí)體瘤CAR-T療法，特別是針對免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的治療，提供了一個(gè)從靶點(diǎn)生物學(xué)到受體生物物理優(yōu)化的綜合性工程框架。