《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Mitochondria Pathway Signature Predicts Prognosis and Therapeutic Response and Identifies REXO2 as a Crucial Regulator in Breast Cancer
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本文提出并驗證了一個基于線粒體相關通路（MRPs）的標簽——線粒體通路標簽（MPAS），其能有效評估乳腺癌患者的預后和治療反應。研究首次在單細胞及空間轉錄組水平描繪了MRPs在乳腺癌中的全景圖，并通過多算法機器學習構建了MPAS預后模型。深入分析發現，高MPAS評分與免疫抑制狀態和炎癥微環境密切相關。SHAP可解釋性分析鑒定出RNA外切酶2（REXO2）為MPAS的關鍵因子，細胞實驗證實REXO2能調控細胞增殖與凋亡，是抑制乳腺癌進展的潛在治療靶點。
1. 引言
乳腺癌（BC）是全球女性中最常見的癌癥，也是導致女性死亡的主要原因之一。預計到2050年，新發病例將達480萬。目前的治療策略包括局部療法（手術和放療）與系統療法（化療和靶向治療），選擇依據疾病分期和分子病理機制。盡管取得了顯著進展，但乳腺癌的全球死亡率仍然很高，因此迫切需要探索其進展的潛在機制并開發新的治療靶點。
線粒體作為細胞能量代謝的關鍵細胞器，在活性氧（ROS）平衡、細胞死亡和脂質轉運等眾多生物過程中發揮著至關重要的作用。越來越多的證據表明，線粒體功能在腫瘤進展和免疫調節中至關重要。然而，各種線粒體相關通路（MRPs）在乳腺癌進展中的作用及其預后價值仍不清楚。
2. 材料與方法
研究整合了來自癌癥基因組圖譜（TCGA）、基因表達綜合（GEO）數據庫的乳腺癌基因表達譜和臨床信息，并收集了MitoCarta3.0數據庫的149個MRPs及其相關蛋白編碼基因列表。采用單樣本基因集富集分析（ssGSEA）評估每個乳腺癌樣本的MRP活性。使用Seurat包進行單細胞分析，并通過CellChat包推斷細胞間通信網絡。空間轉錄組（ST）數據使用Scanpy進行處理。通過單因素Cox分析和包括隨機生存森林（RSF）在內的10種機器學習算法，構建了最優的線粒體通路標簽（MPAS）預后模型，并使用SHAP分析評估各基因貢獻。免疫分析包括計算免疫評分、基質評分和ESTIMATE評分，并從癌癥免疫圖譜（TCIA）數據庫獲取免疫表型評分（IPS）。細胞功能實驗方面，使用了人正常乳腺上皮（MCF10A）和乳腺癌（MDA-MB-468， MDA-MB-231， MCF7）細胞系，通過qRT-PCR檢測基因表達，并使用CCK-8實驗、EdU實驗以及流式細胞術分析細胞增殖與凋亡。
3. 結果
3.1. MRPs在乳腺癌中的表征
研究總體流程如圖1所示。通過比較乳腺癌與正常組織，發現大多數MRPs在腫瘤樣本中被激活，包括氧化磷酸化（OXPHOS）、核苷酸代謝和脂肪酸氧化。而涉及凋亡、線粒體RNA（mtRNA）穩定與降解、線粒體通透性轉換孔（MPTP）的通路則在腫瘤隊列中被顯著抑制。這些發現在乳腺癌單細胞數據集（GSE176078）和空間轉錄組數據中得到了驗證，如圖2所示。
3.2. MPAS在乳腺癌中的建立
為構建最優MPAS模型，研究篩選出86個具有顯著預后價值的潛在MRP基因，并應用10種機器學習方法。基于平均C指數值，選擇了預測性能最佳的RSF+彈性網（Enet）模型用于MPAS開發，如圖3A所示。SHAP算法評估了特征基因對MPAS預測性能的貢獻，根據平均SHAP值排名，前五大特征（REXO2， CASP9， GSTK1， HSPA9， VDAC1）被確定為MPAS模型的核心基因（圖3B）。蜂群圖和瀑布圖進一步確定了REXO2是MPAS的核心組成部分（圖3C， E）。
3.3. MPAS預后性能的驗證
根據MPAS評分中位數，將所有乳腺癌病例分為高、低MPAS亞組。生存分析顯示，高MPAS評分的患者在訓練集和三個獨立驗證隊列（GSE20685， GSE42568， GSE58812）中均表現出顯著不良的臨床結局，如圖4A所示。受試者工作特征（ROC）曲線在TCGA隊列中1年、3年、5年預測的曲線下面積（AUC）分別達到0.814、0.815和0.875，驗證隊列中也表現出可比性能（圖4B）。風險評分分布也顯示了兩個MPAS組間的預后差異（圖4C）。
Cox回歸分析證實MPAS評分是多變量分析后總體生存期（OS）的獨立預后因素。亞組分析進一步表明，MPAS在不同臨床亞組（分期、T分期、N分期）中仍能穩健預測患者結局，如圖5所示。
3.4. MPAS與腫瘤免疫景觀的相關性分析
免疫特征的系統檢測揭示了MPAS亞組之間的不同模式。免疫功能分析顯示，T細胞共抑制、檢查點表達和炎癥促進在高MPAS組中高度富集，如圖6A所示。免疫細胞浸潤估計表明，高MPAS患者抗腫瘤淋巴細胞（包括CD8+T細胞和B細胞）浸潤減少，而免疫抑制成分（如M2巨噬細胞）浸潤增加（圖6B）。低MPAS組中關鍵共刺激基因（如CD70和CD80）表達上調（圖6C），而經典免疫檢查點基因的表達模式在兩組間存在差異（圖6D）。此外，高MPAS組中多種炎癥相關基因（IRGs）上調，且炎癥評分與MPAS評分呈正相關（圖6E， F）。
3.5. MPAS與免疫治療療效的關聯
低MPAS組患者具有更高的腫瘤突變負荷（TMB）值，且低TMB值患者預后較差（圖7A， B）。低MPAS/高TMB亞組表現出更有利的預后（圖7C）。低MPAS組中，抗原呈遞、免疫細胞遷移、T細胞浸潤和腫瘤細胞識別等癌癥免疫循環特征高度富集；而高MPAS組中，免疫檢查點、髓源性抑制細胞（MDSCs）和調節性T細胞（Tregs）等免疫抑制特征顯著富集（圖7D， E）。TIDE分析表明，高MPAS組具有更高的T細胞功能障礙和免疫排斥評分（圖7F-H）。此外，低MPAS組患者具有更高的IPS評分，表明他們可能從免疫檢查點阻斷（ICB）療法中獲得更大益處（圖7I-L）。
3.6. MPAS在乳腺癌中的單細胞景觀
基于中位MPAS評分將所有細胞分為高、低MPAS亞組，如圖8A-C所示。高MPAS組中腫瘤細胞比例更高，且腫瘤細胞的MPAS評分顯著高于其他細胞群（圖8D， E）。CellChat分析顯示，高MPAS細胞表現出顯著更多的細胞間相互作用，且腫瘤細胞與成纖維細胞、內皮細胞之間的通訊在高MPAS組中更強（圖8F-H）。信號通路分析表明，高MPAS組中MDK和CDH1信號通路顯著激活（圖8I）。關鍵配體-受體對（MDK/SDC1和CDH1/ITGB1）在乳腺癌空間轉錄組切片上主要富集于腫瘤區域（圖8J）。
3.7. 功能富集分析
基因集富集分析（GSEA）顯示，高MPAS組富集了炎癥反應、糖酵解和WNT信號通路，而低MPAS組則富集了凋亡、DNA修復和p53通路等標志性通路。
3.8. 藥物敏感性分析
藥物敏感性分析表明，低MPAS組患者對多種化療和靶向藥物（包括GSK269962A、順鉑、多西他賽、吉非替尼和P22077）表現出更高的敏感性。相反，高MPAS組患者對拉帕替尼、雷帕霉素和5-氟尿嘧啶更為敏感。
3.9. REXO2在乳腺癌進展中的功能作用探索
基于SHAP分析線索，REXO2被確定為MPAS的關鍵貢獻因子。人蛋白質圖譜（HPA）數據庫的免疫組化結果顯示，REXO2在乳腺癌組織中顯著上調。在不同細胞系中的表達模式檢測也證實，REXO2在乳腺癌細胞系中高表達。通過qRT-PCR驗證了良好的轉染效率。CCK-8和EdU實驗證實，在MDA-MB-231細胞中沉默REXO2能顯著抑制細胞增殖，而在MDA-MB-468細胞中過表達REXO2則能促進增殖，如圖9E-H所示。流式細胞術分析進一步表明，REXO2敲低可誘導乳腺癌細胞凋亡，而過表達組則觀察到相反結果（圖9I-L）。
4. 結論
研究所提出的線粒體通路標簽（MPAS）能夠有效評估乳腺癌患者的預后和治療反應，為臨床決策提供了新的參考。MPAS評分高的患者往往預后不良，這與免疫抑制狀態和炎癥微環境密切相關。研究首次在單細胞和空間轉錄組水平全面描繪了線粒體相關通路（MRPs）在乳腺癌中的活動全景，并鑒定出RNA外切酶2（REXO2）是MPAS模型的關鍵調控因子。細胞實驗證實，REXO2通過調控細胞增殖與凋亡影響乳腺癌進展，使其成為一個有前景的潛在治療靶點，為開發靶向線粒體的乳腺癌療法提供了新見解。
