土壤鹽漬化是威脅全球農業生產、糧食安全和可持續發展的重大挑戰。向日葵（Helianthus annuusL.）作為鹽堿地的先鋒作物，在改良和利用鹽漬土壤方面發揮著至關重要的作用。然而，向日葵耐鹽性的分子機制尚不完全清楚。本研究通過基因組學和轉錄組學相結合的分析方法，鑒定到一個關鍵的R2R3-MYB轉錄因子基因HaMYB22。功能驗證表明，過表達HaMYB22能顯著增強擬南芥和向日葵的耐鹽性，而沉默該基因則降低耐鹽性。蛋白互作分析揭示，HaMYB22能與HaMYB120和HaMYB181發生相互作用。谷胱甘肽S-轉移酶基因HaGST3.2被鑒定為HaMYB22的直接靶基因，優良單倍型HaMYB22^hap1能夠強烈誘導HaGST3.2的轉錄。此外，HaMYB120和HaMYB181協同增強了HaMYB22對HaGST3.2的轉錄激活作用。在向日葵中沉默HaGST3.2會降低其耐鹽性。我們的研究揭示了HaMYB22–HaGST3.2模塊在向日葵耐鹽性中的重要作用。

向日葵是世界三大油料作物之一，以其對貧瘠土壤、鹽堿、干旱等多種非生物脅迫的耐受性而著稱。鹽脅迫通過滲透脅迫、離子脅迫和次生氧化脅迫等方式影響植物生長，其中過量活性氧（ROS）的積累會造成細胞損傷。植物通過強大的酶促抗氧化防御系統來緩解氧化損傷，谷胱甘肽S-轉移酶（GST）在其中扮演著關鍵角色。同時，轉錄因子（TF）在維持環境脅迫下的細胞穩態中發揮核心作用，R2R3-MYB亞家族是植物中表征最廣泛、最豐富的MYB家族群體，已被證明在植物的多種生理過程、代謝途徑和脅迫適應機制中起調控作用。

通過對135份油葵種質進行全基因組關聯分析（GWAS），并結合鹽脅迫轉錄組數據，鑒定出75個微效數量性狀位點（QTL），分布于17條染色體上，注釋到61個基因。差異表達基因（DEG）分析鑒定出三個鹽脅迫響應基因，其中包括HaMYB22(HanSK08G34500)。在44個有表達量的候選基因中，HaMYB22在NaCl處理3小時后表達量顯著升高（9.6倍）。進一步的RT-qPCR驗證證實，HaMYB22在三個發育階段（萌發期、幼苗Ⅰ期和幼苗Ⅱ期）的根和葉中均被鹽脅迫強烈誘導，且在根中的誘導更強。對HaMYB22QTL側翼區域的連鎖不平衡（LD）塊分析顯示，該LD塊僅包含HaMYB22。因此，HaMYB22被選為鹽脅迫響應的關鍵候選基因。

將HaMYB22在擬南芥（Col-0）中異源過表達。在對照條件下，兩個獨立的HaMYB22-過表達（OE）系（#3和#5）與野生型植株無明顯表型差異。然而，在90 mM和150 mM NaCl處理下，HaMYB22-OE系表現出顯著增強的耐鹽性，其側根長度和數量均顯著優于對照。定量分析顯示，在90 mM和150 mM NaCl處理下，HaMYB22-OE系的側根分別比Col-0長45%和100%，側根數量分別是對照的1.8倍和3.3倍。

鹽脅迫會通過ROS積累引發次生氧化損傷。在150 mM NaCl處理3小時后，組織化學分析顯示，與HaMYB22-OE系相比，Col-0中超氧化物（O₂^•?）和過氧化氫（H₂O₂）的染色顯著更強，定量分析證實了這一觀察。這表明HaMYB22具有減弱鹽誘導ROS損傷的能力。

利用煙草脆裂病毒（TRV）介導的病毒誘導基因沉默（VIGS）系統對向日葵中的HaMYB22進行沉默。RT-qPCR證實了有效的沉默效果。在200 mM NaCl處理下，Vi: HaMYB22植株的葉片表現出明顯的鹽脅迫敏感表型。

在鹽脅迫12小時內，Vi: HaMYB22植株葉片損傷加速。根據葉片組織損傷程度建立的四級分類系統評估顯示，HaMYB22沉默植株中出現不可逆損傷（IV級）的葉片比例顯著高于對照。Vi: HaMYB22在鹽處理1小時后相對含水量（RWC）即低于對照，并在24小時處理期間持續偏低。其葉片皺縮程度比對照高出32.6%。丙二醛（MDA）含量測定顯示，Vi: HaMYB22植株積累了顯著更高的MDA水平，表明其膜脂過氧化損傷更嚴重。NBT和DAB染色顯示，在200 mM NaCl處理3小時后，Vi: HaMYB22葉片和根中的O₂^•?和H₂O₂積累均強于對照。綜上所述，沉默HaMYB22通過增加ROS積累和加劇氧化細胞損傷，削弱了向日葵的耐鹽性。

為研究HaMYB22過表達對向日葵耐鹽性的影響，在兩葉期向日葵幼苗中進行了瞬時過表達實驗。急性暴露于300 mM NaCl 1小時后，對照植株出現明顯萎蔫，而HaMYB22-OE植株保持了葉片完整性。

使用已建立的損傷嚴重程度指標進行評估，HaMYB22-OE植株的損傷主要集中在I-II級。RWC統計結果也證實，在NaCl處理3小時后，對照的RWC顯著低于HaMYB22-OE，且這種模式在整個24小時脅迫期間持續存在。HaMYB22-OE葉片面積僅減少40%，而對照減少超過50%，表明鹽脅迫下對照葉片皺縮更嚴重。

在300 mM NaCl處理1小時后，HaMYB22-OE的MDA含量顯著低于對照，意味著其膜脂損傷保護作用增強。一致地，NBT和DAB染色顯示，HaMYB22-OE植株中O₂^•?和H₂O₂的信號明顯弱于對照。在根中也觀察到了ROS積累的減少。這些發現表明，HaMYB22通過負調控ROS積累來增強植物耐鹽性，且該功能在擬南芥和向日葵中是保守的。

亞細胞定位實驗表明，HaMYB22–GFP融合蛋白在向日葵原生質體和煙草葉片中均主要定位于細胞核。

RT-qPCR分析顯示，HaMYB22在所有發育階段均有表達，在萌發期的子葉、幼苗Ⅰ期的下胚軸、幼苗Ⅱ期的葉片以及開花期的初生根和側根中表達量較高，暗示HaMYB22可能在向日葵不同發育階段扮演多種角色。

酵母轉錄激活實驗表明，全長HaMYB22蛋白具有自激活活性。將HaMYB22分為包含R2R3結構域的N端（HaMYB22-N）和C端（HaMYB22-C），只有C端片段保留了強自激活活性，而包含R2R3的N端片段沒有活性。酵母雙雜交（Y2H）實驗進一步揭示，HaMYB22可以通過R2R3結構域形成同源二聚體。這些數據表明，HaMYB22的轉錄激活功能位于其C端區域，而R2R3結構域對于蛋白二聚化是必需的。

轉錄組數據分析鑒定出五個對NaCl強烈響應的向日葵R2R3-MYB家族基因：HaMYB2、HaMYB22、HaMYB120、HaMYB173和HaMYB181，熱圖分析突出顯示了它們在根組織中的誘導表達。啟動子分析顯示這些基因含有ABRE、TC-rich和MBS等鹽響應順式作用元件。

在大腸桿菌中異源表達pET-32α-HaMYBs顯著增強了細菌在含鹽培養基上的生長，證實了這些HaMYB作為轉錄因子在鹽脅迫響應中的正調控作用。

Y2H實驗揭示了不同的二聚化模式：HaMYB22、HaMYB120和HaMYB173能形成穩定的同源二聚體，而HaMYB2和HaMYB181僅參與異源二聚體相互作用。值得注意的是，HaMYB22作為網絡樞紐，既參與同源二聚化，也與HaMYB120和HaMYB181形成異源二聚體，表明其在鹽脅迫信號傳導中的核心調控作用。

熒光互補成像（LCI）、雙分子熒光互補（BiFC）和體外Pull-down實驗進一步驗證了HaMYB22與HaMYB120/HaMYB181之間的相互作用。這些發現共同確立了HaMYB22是MYB家族中協調鹽脅迫響應的關鍵調控因子。

為了闡明HaMYB22介導的向日葵鹽響應信號通路，對對照和HaMYB22-OE植株在300 mM NaCl處理前及處理后3小時的樣本進行了轉錄組測序分析。五個候選下游靶基因（HaLacs1、HaLEA46、HaLTP、HaGST3.1和HaGST3.2）的啟動子中都含有MYB結合位點，并且均被HaMYB22和NaCl處理顯著誘導。在Vi: HaMYB22植株中進行的RT-qPCR驗證顯示，這五個基因在HaMYB22沉默植株中表達下調，但在鹽脅迫下表現出不同的表達模式，支持它們作為HaMYB22下游靶點在鹽脅迫響應通路中的作用。

酵母單雜交（Y1H）實驗表明，HaMYB22特異性結合HaGST3.2啟動子，表明存在直接的轉錄調控。為了精確定位HaMYB22在HaGST3.2啟動子內的結合片段，將2000 bp序列進行細分。Y1H實驗進一步證明HaMYB22特異性結合HaGST3.2啟動子的F4片段和F4.4片段。基于Y1H結果，后續使用源自該80 bp區域的生物素標記探針（P1/P2）進行了電泳遷移率變動分析（EMSA）。純化的MBP–HaMYB22融合蛋白與兩個探針均形成了遷移阻滯帶，且信號強度隨未標記探針的競爭而減弱，證實了其體外序列特異性的DNA結合能力。在Vi: HaMYB22植株中進行的RT-qPCR分析顯示，HaGST3.2轉錄水平顯著下調，證實了HaMYB22在體內正調控HaGST3.2表達。通過在煙草葉片中共轉染報告基因構建體HaGST3.2_pro: LUC和效應子質粒HaMYB22-FLAG或空FLAG載體進行的雙熒光素酶實驗表明，HaMYB22顯著增強了HaGST3.2_pro驅動的熒光素酶活性，證實了HaMYB22對HaGST3.2的轉錄激活作用。

為研究HaMYB22與HaMYB120、HaMYB181蛋白的相互作用對HaMYB22介導的HaGST3.2調控的協同效應，進行了雙熒光素酶活性實驗。添加HaMYB120或HaMYB181均導致熒光強度顯著增加，表明對HaGST3.2的調控活性增強。這些結果表明，HaMYB22、HaMYB120和HaMYB181之間的相互作用增強了HaMYB22對HaGST3.2的調控效應，從而提高了其表達水平。這種相互作用似乎在調控植物鹽脅迫響應中發揮積極作用。

為研究HaGST3.2在向日葵中的功能，構建了HaGST3.2沉默植株（Vi: HaGST3.2）并用200 mM NaCl處理。與HaMYB22類似，沉默HaGST3.2并未顯著影響正常生長發育。

在Vi: HaGST3.2植株的葉片和根中，HaGST3.2的表達水平在模擬處理和鹽處理下均降低，但在NaCl暴露后仍有所增加，表明沉默有效且HaGST3.2表達受鹽誘導。在200 mM NaCl處理3小時后，Vi: HaGST3.2比對照表現出更嚴重的葉片損傷。對鹽處理葉片的損傷嚴重程度評估顯示，Vi: HaGST3.2在高損傷等級（III級和IV級）的葉片更多，表明其對NaCl脅迫更敏感。Vi: HaGST3.2在鹽脅迫下的葉片相對含水量（RWC）降低，皺縮率增加，表明沉默HaGST3.2加劇了鹽誘導的植物損傷。

對比分析顯示，鹽處理3小時后，Vi: HaGST3.2的MDA含量顯著更高。與此趨勢一致，NBT/DAB染色顯示，鹽脅迫下Vi: HaGST3.2植株葉片和根中的ROS積累高于對照，Vi: HaGST3.2在鹽脅迫下增強的NBT/DAB染色支持了這一結論。這些結果與在Vi: HaMYB22中觀察到的結果一致，共同表明HaGST3.2和HaMYB22都參與調控鹽脅迫下根和葉中的ROS穩態，任一基因的功能缺失都會導致ROS過度積累，從而支持了它們在同一信號通路中協同作用的模型。

為闡明HaMYB22單倍型在群體中的分布，對135份種質資源進行了分析，鑒定出兩種單倍型：HaMYB22^hap1和HaMYB22^hap2。在兩個單倍型之間鑒定出一個單核苷酸多態性（SNP）：在HaMYB22^hap1的R2R3結構域內第271位發生了一個A到T的替換，導致HaMYB22^hap1第90位的氨基酸由蛋氨酸（Met）變為HaMYB22^hap2中的亮氨酸（Leu）。表型分析顯示，單倍型間的干重（DW）存在顯著差異，HaMYB22^hap1的DW顯著高于HaMYB22^hap2，表明HaMYB22^hap1是一個農藝性狀優良的單倍型。

為探究這種表型變異的分子機制，進行了Y1H實驗，發現HaMYB22^hap1與HaGST3.2啟動子的結合親和力顯著高于HaMYB22^hap2。同時，與HaMYB22^hap2相比，HaMYB22^hap1對HaGST3.2的轉錄激活效率顯著更高。綜上所述，這些發現共同確立了HaMYB22^hap1作為對HaGST3.2具有增強的結合和轉錄激活活性的優良單倍型。

本研究結果表明，在向日葵中沉默HaMYB22或HaGST3.2均會顯著削弱植物的耐鹽性。Vi: HaMYB22和Vi: HaGST3.2都表現出相對含水量（RWC）降低和葉片萎蔫率加快。這種耐受性降低可能源于ROS清除能力受損，表現為MDA水平和ROS積累顯著升高。這些生化改變最終導致植物對鹽堿環境的適應能力受損。分子分析表明，HaMYB22直接激活HaGST3.2的表達。蛋白互作實驗顯示，HaMYB120和HaMYB181與HaMYB22發生物理相互作用，而雙熒光素酶實驗進一步證明它們協同增強了HaMYB22介導的對HaGST3.2啟動子的轉錄激活作用。這些發現建立了一個調控模塊，即HaMYB120和HaMYB181通過與HaMYB22相互作用協同上調HaGST3.2的表達，在向日葵適應鹽脅迫中發揮重要作用。

基于這些發現，提出了一個模型來說明HaMYB22–HaGST3.2模塊如何增強植物耐鹽性。在野生型植物中，鹽堿土壤中的高NaCl濃度促進了HaMYB22在細胞核中的積累。隨后，HaMYB22直接結合HaGST3.2啟動子，在HaMYB120和HaMYB181的幫助下激活其轉錄。增加的HaGST3.2減少了植物體內ROS的過度積累。然而，當這條通路受損時，有限的ROS清除能力導致ROS過度積累。在HaMYB22-OE植株中，HaMYB22核水平升高驅動了更強烈的HaGST3.2上調，從而實現了更有效的ROS解毒。這種增強的活性緩解了鹽脅迫誘導的損傷，并顯著增強了植物的耐鹽性。

Y1H結果表明，HaMYB22^hap2中的SNP損害了其DNA結合能力，導致其與HaGST3.2全長啟動子和關鍵調控區F4的結合顯著減弱。相應地，雙熒光素酶報告基因實驗表明，HaMYB22^hap1對HaGST3.2啟動子的反式激活作用顯著強于HaMYB22^hap2。這些分子發現與單倍型的農藝表現數據具有良好的相關性。定量分析顯示，HaMYB22^hap2介導的HaGST3.2激活減少了25%，進一步支持了HaMYB22^hap1作為優良單倍型。

植物生長/發育與抗逆性之間的權衡對于作物生長至關重要，這涉及到能量分配。傳統的作物育種主要側重于優化理想條件下的農藝性狀表現。這也解釋了為什么與野生祖先相比，栽培作物的抗逆性降低，許多抗性等位基因在馴化和改良過程中丟失了。在本研究中，沉默向日葵中的HaMYB22和HaGST3.2并未損害幼苗的生長發育。因此，這些基因對于旨在培育兼具脅迫耐受性和保持產量潛力的品種的育種計劃具有特別的希望。

通過鹽脅迫條件下的轉錄組分析，鑒定出五個在向日葵中強烈響應鹽脅迫的MYB家族基因。值得注意的是，除HaMYB22外，其他四個HaMYB基因在之前的GWAS分析或鹽脅迫轉錄組篩選中均未被檢測到，這表明這些基因可能在向日葵馴化過程中未被選擇。本研究保留的HaMYB22馴化等位基因是影響脅迫適應和產量潛力的雙重功能的罕見實例，其方式與作物改良相關。這一發現表明它們在農業生產中具有直接適用性，可用于培育兼具耐鹽性和穩定產量表現的向日葵品種。同時，仍需通過穩定遺傳轉化和田間試驗進一步驗證這些發現。