《Microbiology Spectrum》：Comparison of clinical and microbiological features between mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa in non-cystic fibrosis bronchiectasis
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本研究首次系統對比了非囊性纖維化支氣管擴張(NCFB)患者體內黏液型與非黏液型銅綠假單胞菌的臨床及生物學差異。研究發現，黏液型菌株與更差的肺功能（FEV1% predicted：52.3?±?15.7 vs 63.8?±?17.2）、更頻繁的急性加重（2.4?±?1.3 vs 1.5?±?1.0次/年）及更快的氣道破壞相關，且其對抗生素（頭孢他啶、環丙沙星、妥布霉素）的耐受性更強，但細胞毒性較低。機制研究表明，黏液型菌株的藻酸鹽生物合成基因（如algD、algU）顯著上調，而運動性和急性毒力基因（如exoS、lasB）下調。這提示傳統藥敏測試低估了黏液型感染的挑戰，臨床需發展針對其獨特生物學特性的治療策略。
摘要
銅綠假單胞菌是導致非囊性纖維化支氣管擴張(NCFB)患者病情加重和預后不良的關鍵病原體。其中，能夠過量分泌藻酸鹽形成黏液表型的菌株，其臨床意義和生物學特性在NCFB中遠不如在囊性纖維化(CF)中研究得透徹。本回顧性研究通過對66例分離出銅綠假單胞菌的NCFB患者進行分析，系統地比較了黏液型與非黏液型菌株在臨床結局、微生物學特性及分子機制上的差異。研究發現，黏液型銅綠假單胞菌感染與更嚴重的疾病負擔、更高的抗生素耐受性以及獨特的基因表達譜相關，而這些特征無法通過常規的藥敏試驗所揭示。
引言
支氣管擴張是一種慢性、進行性、不可逆的氣道疾病，其特征是異常的、永久性的支氣管擴張、黏液纖毛清除功能受損以及反復的下呼吸道感染。非囊性纖維化支氣管擴張(NCFB)的患病率在全球范圍內呈上升趨勢。在眾多病原體中，銅綠假單胞菌因其與更嚴重的疾病、更頻繁的急性加重、更快的肺功能下降以及更高的住院和死亡風險相關，而被認為是臨床意義最為顯著的病原體。一旦在氣道定植，銅綠假單胞菌極難根除。其持久性得益于該生物強大的表型適應能力和抗菌素耐藥性的發展。其中，黏液表型的出現——以過量產生胞外多糖藻酸鹽為特征——是慢性氣道定植的標志，被認為在疾病進展中扮演著關鍵角色。然而，此前大多數關于支氣管擴張的研究主要關注銅綠假單胞菌整體的檢出，并未特別區分黏液型與非黏液型表型。因此，這兩種表型在疾病進展和臨床管理中的獨特作用尚不清楚。
材料與方法
本研究為單中心回顧性研究，于2021年1月至2024年12月期間進行。共納入66例NCFB成人患者，從其痰液或支氣管肺泡灌洗液標本中分離出非重復的銅綠假單胞菌臨床分離株，其中32株為黏液型，34株為非黏液型。黏液型菌株通過在LB瓊脂或假單胞菌分離瓊脂上形成光滑、粘稠、閃亮的菌落來鑒定，而非黏液型菌株則呈現干燥、粗糙、非粘稠的菌落。所有菌株均進行抗菌藥物敏感性測試、細胞粘附實驗、細胞毒性實驗、時間-殺菌動力學實驗以及實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)基因表達分析。
結果：黏液型與非黏液型銅綠假單胞菌在NCFB中的臨床特征
兩組患者在年齡、性別分布及常見合并癥方面具有可比性。然而，黏液型組患者的支氣管擴張病程顯著更長（11.2 ± 6.4 vs 7.8 ± 5.2年）。影像學評估顯示，黏液型組中囊狀支氣管擴張（43.8% vs 20.6%）和彌漫性受累（≥3個肺葉，68.8% vs 44.1%）更為常見，并且CT嚴重程度評分更高（11.5 ± 3.2 vs 8.9 ± 3.1）。肺功能方面，黏液型組患者的FEV1占預計值百分比顯著更低（52.3 ± 15.7 vs 63.8 ± 17.2），并且更常報告慢性咳痰（84.4% vs 61.8%）。在炎癥標志物中，痰液IL-8水平在黏液型組中顯著更高。
結果：黏液型與非黏液型銅綠假單胞菌感染患者的臨床結局
在過去一年中，黏液型組患者的臨床結局顯著更差。其年平均急性加重次數（2.4 ± 1.3 vs 1.5 ± 1.0）、住院次數（1.2 ± 0.9 vs 0.7 ± 0.7）和總住院天數（14.2 ± 10.5 vs 8.3 ± 9.1）均更高。黏液型組患者的抗菌治療負擔也更重，包括更頻繁的靜脈抗生素療程、更多的口服抗生素治療天數以及更高的長期吸入抗生素使用率。在長期結局方面，黏液型組患者的FEV1年下降率更快（-2.9% ± 2.1% vs -1.6% ± 1.8%）。
結果：黏液型銅綠假單胞菌表型與臨床特征及結局的關聯
多變量邏輯回歸分析顯示，支氣管擴張病程延長、存在囊狀支氣管擴張以及基線FEV1%預計值較低，均與黏液型表型的存在獨立相關。在校正年齡、病程、基線肺功能和CT評分后，黏液型銅綠假單胞菌感染/定植仍與更頻繁的急性加重、更多的年住院次數以及更快的FEV1下降獨立相關。
結果：抗菌藥物敏感性及多藥耐藥譜
黏液型與非黏液型分離株對各類抗菌藥物的體外敏感性譜沒有顯著差異。兩組對碳青霉烯類（亞胺培南、美羅培南）、頭孢菌素類、氨基糖苷類、β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑復合制劑、氟喹諾酮類等的耐藥率均相似。此外，多藥耐藥(MDR)和廣泛耐藥(XDR)表型的發生率在兩組中也相近。
結果：黏液型分離株表現出比非黏液型分離株更高的抗生素耐受性
時間-殺菌動力學實驗評估了黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌對四種臨床相關抗假單胞菌藥物的殺菌活性。結果顯示，對于頭孢他啶、環丙沙星和妥布霉素，非黏液型分離株表現出快速且持續的殺滅作用，而黏液型分離株則顯示出減弱的殺菌反應，早期對數減少值較小，并在24小時出現明顯的細菌再生長。相比之下，多粘菌素對兩組菌株的殺滅動力學相似。
結果：黏液型分離株表現出增強的粘附性但細胞毒性降低
體外細胞實驗表明，黏液型分離株對兩種人氣道上皮細胞系（16HBE和BEAS-2B）的粘附能力均顯著高于非黏液型分離株。相反，在感染后6小時，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放評估細胞毒性發現，黏液型分離株對兩種細胞系造成的損傷均顯著低于非黏液型分離株。這表明黏液型銅綠假單胞菌更傾向于穩定、長期地定植于氣道上皮，而非造成急性的上皮破壞。
結果：黏液型與非黏液型銅綠假單胞菌中藻酸鹽、運動性、毒力及耐藥基因的差異表達
基因表達譜分析揭示了表型差異的分子基礎。與非黏液型分離株相比，黏液型分離株的藻酸鹽生物合成和調控基因（如algD、algU、mucA）表達顯著上調。相反，與運動性相關的基因（如motA、fliC）以及主要毒力和分泌系統基因顯著下調，特別是編碼III型分泌系統(T3SS)效應蛋白（exoS、exoT、exoY）和II型分泌系統(T2SS)蛋白酶（lasA、lasB）的基因。然而，關鍵的抗生素耐藥性和外排泵基因（如mexB、mexY）的表達在兩組間基本無變化。
討論
本研究表明，在NCFB患者中，感染黏液型銅綠假單胞菌與更嚴重的結構性肺病、更差的肺功能以及更不良的臨床結局相關。重要的是，這些關聯是在兩組菌株體外藥敏譜基本相當的背景下觀察到的，這提示傳統耐藥機制以外的因素導致了更差的臨床病程。時間-殺菌實驗清晰地證明，黏液型分離株對抗生素（頭孢他啶、環丙沙星、妥布霉素）的耐受性增強，表現為殺菌反應減弱和細菌再生長，這反映了“耐受性”和“持留性”，而非經典耐藥性突變。這種增加的耐受性并非源于主要外排泵系統的基因上調，而主要歸因于藻酸鹽相關基因的上調。
體外粘附和細胞毒性實驗進一步闡明了黏液型銅綠假單胞菌的致病生物學：其表現出更強的粘附能力和更低的急性細胞毒性。這種“高粘附、低毒力”的表型，輔以藻酸鹽基因上調和急性毒力基因下調的分子特征，表明黏液型菌株已適應于氣道上皮的穩定、長期定植。這種適應策略使其能夠逃避宿主免疫清除，同時通過持續的炎癥反應導致進行性的氣道損傷。
結論
本研究證實，NCFB中的黏液型銅綠假單胞菌感染與更嚴重的臨床表現、增強的抗生素耐受性以及以粘附性增強和急性毒力降低為特征的獨特分子印記相關。這些發現凸顯了在慢性銅綠假單胞菌感染管理中，僅依靠常規耐藥性檢測的不足，并強調需要針對黏液表型獨特生物學的創新策略。將表型和分子譜分析整合到臨床決策中，可能有助于改善風險分層并指導靶向治療的發展。
