《PLOS One》：Physiological and biochemical characterization of trypsin from Neocaridina denticulata sinensis and its roles in ontogenesis and immune response
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本文系統(tǒng)地研究了中華鋸齒新米蝦（Neocaridina denticulata sinensis）胰蛋白酶基因（NdTryp）的分子特征、表達模式及其生理功能。研究表明，NdTryp在肝胰腺中高表達，在胚胎后期（孵化與開始攝食階段）表達急劇升高，并能在副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染后被誘導上調(diào)。RNA干擾（RNAi）敲低 NdTryp會加劇感染后肝胰腺損傷（包括上皮脫落與基底膜破壞）。生化分析顯示，重組 NdTryp（rNdTryp）在寬溫寬pH范圍內(nèi)均具有高蛋白酶活性，其活性受金屬離子調(diào)節(jié)（二價陽離子增強，三價鐵抑制）。本研究首次揭示了 NdTryp 在甲殼動物晚期胚胎發(fā)育與固有抗菌防御中的多重作用，并凸顯了其在飼料添加劑與酶法生物轉(zhuǎn)化中的潛在應(yīng)用價值。
1. Introduction
胰蛋白酶是甲殼動物體內(nèi)一種典型的絲氨酸蛋白酶，在蛋白質(zhì)降解、消化、胚胎發(fā)育和免疫防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，蝦類是具有重要經(jīng)濟價值的產(chǎn)品。一方面，副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是常見的甲殼動物病原體，可引起急性肝胰腺壞死綜合征，造成嚴重的經(jīng)濟損失；另一方面，蝦類捕撈后的貨架期常因胰蛋白酶催化的肌肉組織降解而受到限制。中華鋸齒新米蝦（Neocaridina denticulata sinensis）因其繁殖率高、生命周期短、飼養(yǎng)簡單等優(yōu)點，常被用作生理與生態(tài)學研究的模式動物。然而，目前對該蝦中胰蛋白酶（NdTryp）的基本信息知之甚少，包括其全長基因序列、組織表達譜、發(fā)育動態(tài)、抗菌防御中的功能以及金屬離子敏感性等生化性質(zhì)。因此，本研究以中華鋸齒新米蝦為模型，旨在全面解析其胰蛋白酶基因（NdTryp）的結(jié)構(gòu)特征、表達模式與功能，并探討其潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。
2. Materials and methods
2.1. Experimental animals
健康蝦樣本來自中國河北省保定市安新縣的當?shù)厥袌觥嶒炃埃r在循環(huán)水族箱中馴化7天，水溫保持在25±1°C，光暗周期為12:12小時。
2.2. Gene cloning
胰蛋白酶基因序列從已發(fā)表的全長轉(zhuǎn)錄組中鑒定，并設(shè)計基因特異性引物。通過PCR擴增獲得全長cDNA，連接至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞進行測序。
2.3. Bioinformatics analysis of NdTryp
利用NCBI BLAST分析全長cDNA序列，預(yù)測功能位點與理論等電點（pI）。通過SMART進行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，并用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用SWISS-MODEL在線服務(wù)器預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。
2.4. Methodology of RNA interference (RNAi)
設(shè)計靶向NdTrypORF的引物合成雙鏈RNA，采用dsNdTryp注射進行基因敲低，dsEGFP作為陰性對照。
2.5. Experimental challenge with V. parahaemolyticus
使用攜帶毒力基因PirAVP和PirBVP的副溶血弧菌菌株進行感染實驗。將細菌濃度調(diào)整為1×106CFU/mL后，對蝦進行注射。
2.6. Quantitative real-time PCR (qPCR) assay
收集蝦的不同組織（腸道、肌肉、卵巢、鰓、表皮、精巢、胃、心臟、眼柄、肝胰腺和腹神經(jīng)）及不同胚胎發(fā)育階段的樣本，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以18S核糖體RNA為內(nèi)參，通過qPCR分析NdTryp的表達譜。
2.7. Methodology of hematoxylin-eosin (H&E) staining
取肝胰腺組織固定、脫水、石蠟包埋后切片，進行H&E染色以觀察組織形態(tài)。
2.8. In situ hybridization (ISH) of NdTryp mRNA-expressing cells
采用原位雜交技術(shù)定位NdTrypmRNA在肝胰腺中的細胞表達。
2.9. Prokaryotic expression, purification, and enzymatic activity assay of recombinant NdTryp (rNdTryp)
構(gòu)建pCT7-CHISP6H-NdTryp表達載體，轉(zhuǎn)化至BL21-Star(DE3) pLysS感受態(tài)細胞中進行原核表達，通過Ni2+-NTA柱親和層析純化蛋白，并測定其酶活。
2.10. Biochemical characterization of rNdTryp
評估rNdTryp在不同溫度、pH及金屬離子條件下的酶活性。
2.11. Statistical analysis
數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，采用SPSS進行統(tǒng)計分析，多組比較使用單因素ANOVA，兩兩比較采用t檢驗。
3. Results
3.1. Characteristics of the NdTryp gene and its deduced amino acid (aa) in N. denticulata sinensis
NdTryp的全長cDNA為906 bp，包含801 bp的開放閱讀框，編碼266個氨基酸，預(yù)測pI為4.26。該蛋白含有一個Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域，具有三個活性位點（His 74、Asp 125和Ser 218）和鈣離子結(jié)合位點（Asp 185、Asp 199、Met 201、Glu 253）。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示NdTryp屬于軟甲綱的胰蛋白酶分支。
3.2. qPCR analysis of the distribution of NdTryp in different tissues and during shrimp ontogenesis
NdTryp在所有測試組織中均有表達，其中肝胰腺中表達量最高（約76533.5倍），其次是精巢。在胚胎發(fā)育過程中，早期胚胎階段（囊胚期、卵裂期、原腸期、前無節(jié)幼體期和后無節(jié)幼體期）未檢測到表達；在眼點色素形成前期開始出現(xiàn)表達，并在眼點色素形成后期、溞狀幼體期及幼體期急劇升高并維持在較高水平。
3.3. Response of NdTryp mRNA expression under V. parahaemolyticus challenge
感染副溶血弧菌后，NdTryp的表達呈時間依賴性上調(diào)，在24 h達到峰值，約為0 h的3倍。敲低NdTryp后進行細菌攻擊，可導致肝胰腺組織出現(xiàn)部分壞死、上皮細胞（ECT）與儲存細胞（R-cell）脫離基底膜，以及基底膜局部破裂等嚴重病理損傷。
3.4. Localization of NdTryp mRNA expression in hepatopancreas
原位雜交結(jié)果表明NdTrypmRNA主要定位于肝胰腺的儲存細胞（R-cells）和管腔上皮細胞（ECTs），而在分泌細胞（B-cells）中未檢測到信號。
3.5. Purification of rNdTryp and detection of enzymatic activity
SDS-PAGE顯示純化的rNdTryp為單一條帶，分子量約35 kDa，酶活測定為233.78 ± 4.07 U/mL。
3.6. Enzymatic characterizations of rNdTryp
rNdTryp的最適pH約為8.0，在堿性范圍內(nèi)保持高活性，但在酸性條件下迅速失活。最適溫度為35°C，60°C時活性顯著下降（相對活性約7.18%）。在金屬離子影響方面，Cd2+、Cu2+、Mn2+能顯著增強酶活，而K+、Mg2+、Fe3+則表現(xiàn)出抑制作用，其中Fe3+抑制約71%。
4. Discussion
4.1. Structural features and evolutionary conservation of NdTryp
NdTryp的催化三聯(lián)體為His 74、Asp 125、Ser 218，與已報道的典型胰蛋白酶結(jié)構(gòu)略有差異。其三維模型顯示兩個β-桶狀結(jié)構(gòu)域堆疊，催化殘基位于其交界處，這種結(jié)構(gòu)有助于維持酶的穩(wěn)定性。
4.2. NdTrypexpression and its biological significance
NdTryp在肝胰腺中的高表達與該器官的消化與免疫功能相吻合。其在胚胎后期的高表達可能為孵化及自主攝食提供必要的消化酶。此外，胰蛋白酶還可能通過切割蛋白酶激活受體2（PAR-2）參與細胞信號傳導。
4.3. Proposed immune mechanisms
肝胰腺是蝦類重要的免疫器官。NdTryp在副溶血弧菌感染后表達上調(diào)，其敲低導致肝胰腺壞死加劇，提示其可能在免疫防御中發(fā)揮重要作用。可能的機制包括作為轉(zhuǎn)化酶激活抗菌肽前體，或參與酚氧化酶原（proPO）系統(tǒng)的激活，進而促進黑色素形成以限制病原體擴散。
4.4. Biochemical properties and biotechnological potential
rNdTryp在較寬的溫度與pH范圍內(nèi)保持高活性，并受多種金屬離子調(diào)節(jié)。其在工業(yè)上具有潛在應(yīng)用價值，例如作為水產(chǎn)飼料添加劑以提高養(yǎng)分消化率，或作為食品廢棄物降解的生物催化劑。
5. Conclusions
本研究首次報道了中華鋸齒新米蝦胰蛋白酶（NdTryp）的全長cDNA序列。NdTryp在肝胰腺中表達最高，主要定位于R-cells和ECTs。其在胚胎早期不表達，但在后期急劇上升。感染副溶血弧菌可誘導其表達上調(diào)，而敲低表達則會削弱蝦的抗感染能力，導致肝胰腺損傷。重組NdTryp（rNdTryp）展現(xiàn)出寬溫寬pH的蛋白酶活性，提示其作為飼料添加劑或生物催化劑的潛力。綜上所述，NdTryp在中華鋸齒新米蝦的胚胎發(fā)育與抗菌防御中扮演關(guān)鍵角色，其良好的酶學性質(zhì)為其工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
