《Small》：Sequential Optimization of Multivariate Metal–Organic Framework Based Biocatalysis
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這篇研究性論文（非綜述）的核心在于提出并驗證了一種將多變量材料設計與序貫機器學習優化相結合的創新策略。研究者通過拉丁超立方采樣耦合貝葉斯優化（LHS-BO）工作流，系統地優化了基于鋯（Zr）的多變量酶@金屬有機框架（E-MOF）生物復合材料的合成，并進而優化了其下游葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶（GOx-HRP）雙酶級聯反應的條件。文章表明，該集成方法能夠高效地設計出具有高封裝效率（EE）、高保留活性（REA）和增強穩定性的高性能E-MOF生物催化劑，并實現超過95%理論最大值的產物（2,3-二氨基吩嗪，DAP）生成速率，為復雜生物催化系統的理性設計與優化提供了強有力的通用框架。
引言
高效的生物催化過程需要對生物催化劑和反應條件進行集成優化。受自然界生物分子結構的啟發，金屬有機框架（MOFs）已成為有前景的酶固定化平臺，所形成的酶@MOF（E-MOF）生物催化劑能提供生物相容的微環境，增強酶的穩定性和可回收性。然而，實現高封裝效率和高保留酶活性仍具挑戰。傳統單配體MOF系統表面相對均質，往往導致酶-MOF界面相互作用欠佳。多變量配體策略通過精細調節疏水性和電荷，可定制酶-MOF界面，創造優化的微環境。此外，反應條件在級聯反應中也起決定性作用，但以往研究多將反應性能作為材料表征工具，對反應條件進行系統優化以提升級聯生產率的研究相對被忽視。機器學習已被分別應用于E-MOF合成和酶催化優化的研究，但目前尚無研究報道對E-MOF合成及其下游生物級聯條件進行集成優化的序貫機器學習策略。
本研究通過結合多變量材料設計和序貫機器學習優化策略來解決這些挑戰。具體而言，研究者采用拉丁超立方采樣-耦合迭代貝葉斯優化（LHS-BO）工作流來指導整個生物催化優化研究。
結果與討論
考慮到酶-MOF界面相容性的重要性，研究首先分析了葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根過氧化物酶（HRP）的表面化學性質。分析表明，兩者的表面電勢和親疏水域分布存在顯著差異，這提示它們與功能化配體的相互作用可能不同，因此其最優E-MOF合成條件也應不同。為此，本研究采用了多變量羧酸配體策略，使用疏水的ibdc-hexane、中性親水的ibdc-EG以及帶正電荷的ibdc-TEA配體，在Zr基E-MOF生物界面中模擬蛋白質的異質性表面特征，為每種酶創建量身定制的微環境。
利用LHS-BO工作流，研究者定義了包含ZrOCl2、三種功能化ibdc配體及酶濃度的合成設計空間。拉丁超立方采樣用于高效選擇代表性的種子條件，迭代貝葉斯優化則用于微調這些條件以最大化固定化性能。梯度提升模型被用作工作流中的替代模型。為了平衡酶成本和活性保留，采用性能指數作為優化目標。結果表明，E-MOFGOx和E-MOFHRP的封裝效率、保留活性和性能指數值在不同的合成條件下變化很大，這證明了前體濃度和配體組成對固定化性能的強烈影響，也支持了多變量配體設計策略的基本原理。
特征重要性分析揭示了影響固定化性能的關鍵因素。對于兩種E-MOF，ibdc-hexane的用量是影響封裝效率的最重要因素，而ibdc-TEA對封裝效率有負面影響。對于保留活性的預測，兩種酶的關鍵因素不同：在E-MOFGOx中，ibdc-hexane和ibdc-TEA強烈影響保留活性；而在E-MOFHRP中，ibdc-EG是主導因素，這與文獻中聚乙二醇能穩定HRP三級結構的報道一致。
研究確定了ZG67和ZH16分別為性能最佳的E-MOFGOx和E-MOFHRP。ZG67表現出92.2% ± 0.7%的封裝效率和87.1% ± 2.2%的保留活性；ZH16表現出90.2% ± 1.3%的封裝效率和相對于游離HRP高達1020.9%的保留活性。兩者在熱應激和有機溶劑暴露條件下均保留了大部分生物活性，而游離酶在相同條件下活性大幅喪失。控制實驗表明，表面吸附酶的樣品并未表現出穩定性提升，證實了觀察到的保護作用源于酶在E-MOF基質內的封裝。
衰減全反射傅里葉變換紅外光譜分析顯示，封裝后兩種酶的二級結構發生了顯著變化，α-螺旋含量增加，無規卷曲減少，表明封裝能穩定更有序的、具有催化活性的酶構象。紫外可見光譜分析也支持了酶微環境的變化。
研究提出，觀察到的生物活性增強部分源于酶-MOF界面獨特的微環境。E-MOF環境可能通過限制和界面相互作用，在接近中性的本體條件下局部穩定質子化狀態，從而功能性地模擬酶的酸性激活。pH依賴性活性測試和酶吸附實驗的結果支持了這一假設。
在確定了最佳生物催化劑后，研究應用LHS-BO工作流優化GOx-HRP級聯反應。在典型的級聯反應中，葡萄糖被GOx氧化生成H2O2，HRP隨后利用H2O2>氧化鄰苯二胺生成2,3-二氨基吩嗪。在優化工作流中，將葡萄糖、ZG67、ZH16和鄰苯二胺的濃度作為變量，初始DAP生成速率作為優化目標。
經過52次實驗，研究確定了R49為GOx-HRP生物級聯的最佳反應條件。訓練好的梯度提升模型能準確預測DAP生成速率。特征重要性分析表明，ZG67和葡萄糖的濃度是影響DAP生成速率的兩個主導因素，提示GOx催化的H2O2生成是級聯反應的限速步驟。這一發現與對ZG67和ZH16的詳細動力學分析結果一致。動力學分析顯示，封裝提高了兩種酶的最大反應速率和轉換數，其中HRP的轉換數提升尤為顯著。同時，封裝也增加了米氏常數，反映了E-MOF基質內的擴散障礙。
基于實驗測得的動力學參數，研究者開發了一個微動力學模型來模擬DAP生成。該模型與實驗數據高度吻合。使用該模型對超過9萬種可能的反應條件進行篩選，確定了理論最優條件K1。實驗上，K1實現了與預測非常接近的DAP生成速率。值得注意的是，LHS-BO工作流獨立確定的R49條件，僅通過52次實驗就實現了理論最優值K1的95.5%。這凸顯了LHS-BO工作流在高效識別接近最優的生物級聯條件方面的潛力，同時也能捕捉反應的關鍵機理特征。
結論
本研究提出了一種用于E-MOF基生物催化序貫優化的策略，集成了多變量設計與機器學習指導的反應優化。利用LHS-BO工作流，研究者序貫優化了E-MOF合成和下游GOx-HRP生物級聯，實現了超過95%理論最大DAP生成速率。混合配體Zr基E-MOF有效地將GOx和HRP穩定在其生物活性構象中，提供了高封裝效率、高保留活性以及在多變pH、熱和溶劑條件下的魯棒性。重要的是，實驗結果、動力學模型和機器學習預測在DAP生成速率值上表現出高度一致性，證實了這種集成方法的可靠性。總體而言，這項工作為多酶級聯系統的自適應設計建立了一個通用框架，將宿主工程和反應優化相結合，以實現穩健、高性能的生物催化。
實驗部分
所有化學品和溶劑均購自商業來源并按原樣使用。功能化間苯二甲酸配體根據文獻方法合成。
E-MOF的系統篩選：典型合成中，將所需體積的ZrOCl2·8H2O、三種ibdc配體、酶和水混合。合成總體積為0.5 mL，在室溫下旋轉孵育30分鐘。通過離心收集沉淀物并清洗。上清液用于BCA測定以計算封裝效率。
粉末X射線衍射：使用配備Cu Kα輻射的衍射儀進行。
衰減全反射傅里葉變換紅外光譜分析：使用紅外光譜儀在2200至400 cm-1光譜范圍內收集光譜。
Zeta電位測量：使用動態光散射儀在pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中測量。
溶液態核磁共振：使用核磁共振波譜儀進行。
封裝效率的定量：使用BCA法測定上清液中的酶濃度，并計算封裝效率。
GOx和E-MOFGOx的酶活測定：以鄰苯二胺為底物，在96孔板中監測418 nm處吸光度的變化，評估GOx活性。
HRP和E-MOFHRP的酶活測定：以H2O2為底物，鄰苯二胺為氫供體，監測418 nm處吸光度的變化，評估HRP活性。通過初始反應速率計算保留酶活性。
機器學習輔助實驗規劃：種子數據集的實驗規劃采用拉丁超立方采樣。貝葉斯優化算法與梯度提升回歸模型結合使用，通過最大化期望改進采集函數來識別有前景的E-MOF候選物。在迭代階段，從算法生成的30個設計中，根據預測的性能指數值降序排列，選擇前12個候選物進行進一步評估。
