為了研究機械壓力對髓核細胞（NPC）生存的影響，研究人員對體外培養(yǎng)的人髓核細胞施加了1.0 MPa的靜態(tài)壓力。結(jié)果顯示，細胞活力隨時間顯著下降，并在處理72小時后達到最低點。

為了表征細胞死亡的性質(zhì)，研究首先使用了泛Caspase抑制劑Z-VAD。然而，細胞活力染色表明，Z-VAD預處理未能有效阻止壓力誘導的髓核細胞死亡。進一步的分子標記檢測顯示，機械壓力顯著上調(diào)了Cleaved Caspase-3（細胞凋亡標志）、GSDMD-N（焦亡標志）和磷酸化MLKL（p-MLKL，壞死性凋亡標志）。值得注意的是，Z-VAD處理雖然抑制了Caspase-3和GSDMD-N，但未能降低p-MLKL的蛋白水平，這表明存在PANoptosis（一種協(xié)調(diào)的細胞死亡程序）的激活，并解釋了單獨使用Z-VAD效果有限的原因。

為了確定PANoptosis是否是細胞死亡的唯一驅(qū)動因素，研究人員聯(lián)合使用了Z-VAD和RIPK1抑制劑Necrostatin-1。盡管這種組合有效阻斷了PANoptosis的關(guān)鍵通路，仍有大量細胞死亡，其活力仍顯著低于對照組。這種在阻斷PANoptosis通路后仍持續(xù)存在的細胞死亡提示，可能存在另一種不依賴Caspase和RIPK的機制起關(guān)鍵作用。

為闡明具體的潛在機制，研究人員對受壓細胞進行了轉(zhuǎn)錄組測序�；�因集富集分析（GSEA）顯示，與DNA損傷反應相關(guān)的基因集顯著富集，暗示DNA損傷可能是這種殘余的、耐藥性細胞死亡的驅(qū)動因素。彗星實驗直接證實了這一點，顯示髓核細胞在加壓24和48小時后，尾部DNA百分比顯著增加。蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光染色進一步表明，DNA雙鏈斷裂的關(guān)鍵標志物γ-H2AX的蛋白水平和熒光強度均被強烈誘導。

研究進一步驗證了這些發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性。對人類椎間盤（IVD）組織切片的染色顯示，γ-H2AX的信號強度與椎間盤退變程度呈正相關(guān)。此外，從退變椎間盤分離的原代髓核細胞也表現(xiàn)出更高的基礎(chǔ)DNA損傷水平，支持了DNA損傷與椎間盤退變之間的病理聯(lián)系。

研究進一步探討了DNA損傷的來源。壓力誘導了人髓核細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的急劇升高，并導致氧化性DNA損傷標志物8-羥基-2'-脫氧鳥苷（8-OHdG）在細胞和人類退變椎間盤組織中的顯著積累，確定了氧化應激是DNA損傷的主要驅(qū)動因素。為確定這種氧化應激的上游起源，研究人員檢測了線粒體完整性。結(jié)果顯示，機械壓力誘導線粒體膜電位（MMP）顯著且呈時間依賴性地下降，證實線粒體去極化驅(qū)動了觀察到的ROS積累。

持續(xù)的DNA損傷和PARP激活通常會導致細胞內(nèi)NAD⁺的耗竭。正如預期，研究發(fā)現(xiàn)壓力顯著降低了髓核細胞中的NAD⁺/NADH比率，這一現(xiàn)象在人類退變椎間盤組織中得到證實。為建立ROS、DNA損傷和細胞死亡之間的因果關(guān)系，研究人員進行了拯救實驗。彗星實驗顯示，ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）有效緩解了壓力誘導的DNA損傷，而補充NAD⁺前體煙酰胺單核苷酸（NMN）則無此效果。相應地，在細胞活力實驗中，NAC處理顯著逆轉(zhuǎn)了壓力誘導的髓核細胞死亡，而NMN未提供保護作用。

總之，本部分結(jié)果表明，機械壓力通過誘導氧化應激，在髓核細胞中引發(fā)嚴重的DNA損傷和NAD⁺耗竭，最終導致不依賴Caspase的細胞死亡。

由于這種未知的細胞死亡機制涉及嚴重的DNA損傷和NAD⁺耗竭——這是PARthanatos的標志性特征——研究人員接下來研究了PAR聚合物積累在這一過程中的核心作用。免疫熒光染色顯示，在機械壓力處理24和48小時后，髓核細胞胞漿和細胞核中的PAR水平均呈時間依賴性顯著增加。

為確認PAR積累的來源和功能意義，研究人員使用了PARP抑制劑進行干預。蛋白質(zhì)印跡分析證實，預處理PARP抑制劑AG或ABT顯著阻斷了壓力誘導的PAR聚合物生成。更重要的是，功能拯救實驗表明，抑制PARP或MIF活性顯著逆轉(zhuǎn)了機械壓力誘導的髓核細胞死亡，證明了PAR積累的細胞毒性效應。免疫熒光結(jié)果顯示，機械壓力誘導了AIF、MIF和PAR的上調(diào)。這個過程被PARP或MIF抑制劑有效抑制。核質(zhì)分離實驗進一步證實，壓力誘導的MIF蛋白從細胞質(zhì)向細胞核的易位——這是PARthanatos執(zhí)行過程中的標志性事件——同樣被ABT或4-IPP（一種選擇性MIF抑制劑）處理所阻斷。

此外，研究人員利用免疫熒光檢查了AIF和MIF的細胞定位。結(jié)果顯示，機械壓力誘導AIF在細胞核中顯著積累，其動態(tài)與MIF相似。同樣，這種核轉(zhuǎn)位可被ABT和4-IPP有效抑制。這兩種蛋白對這些抑制劑的同步反應表明，它們在機械壓力誘導的細胞死亡過程中的核轉(zhuǎn)位過程中扮演協(xié)同作用。此外，ABT處理阻止了壓力誘導的細胞內(nèi)NAD⁺/NADH比率的下降，從能量代謝的角度支持PARP抑制維持了細胞穩(wěn)態(tài)。

為了探索PAR聚合物在椎間盤退變中的潛在長期效應，研究人員用外源性PAR處理體外培養(yǎng)的髓核細胞。首先，為確認外源性PAR能否有效穿透細胞膜，合成了Cy5.5標記的PAR。共聚焦顯微鏡顯示，PAR-Cy5.5的紅色熒光清晰地定位在由F-肌動蛋白細胞骨架限定的細胞質(zhì)內(nèi)，驗證了其被髓核細胞有效內(nèi)化。

隨后進行了轉(zhuǎn)錄組測序。GSEA分析顯示Hippo信號通路被顯著激活，已知該通路與椎間盤退變進展密切相關(guān)。為闡明這種激活的關(guān)鍵分子事件，研究人員檢測了Hippo通路核心效應子YAP的磷酸化狀態(tài)。蛋白質(zhì)印跡分析表明，與對照組相比，外源性PAR處理顯著上調(diào)了磷酸化YAP（p-YAP）的水平，導致p-YAP/總YAP比率顯著增加。這種磷酸化事件通常會阻止YAP核轉(zhuǎn)位，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。與此機制一致，隨后的qPCR驗證表明，Hippo通路關(guān)鍵下游效應因子，包括CCN2、MYC和CCN1的轉(zhuǎn)錄水平被顯著抑制。因此，異常的PAR積累可能通過持續(xù)抑制促生存信號通路，間接促進髓核細胞功能障礙和退變微環(huán)境的形成。

為確認PAR積累的臨床相關(guān)性，研究人員檢測了人類椎間盤組織樣本。免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果一致顯示，與輕度退變組織相比，嚴重退變的椎間盤組織中PAR水平顯著升高，表明PAR積累與人類椎間盤退變嚴重程度呈正相關(guān)。此外，隨著椎間盤退變加重，AIF和MIF蛋白表達水平逐漸增加，提示PARthanatos參與了椎間盤退變的進程。

最后，為在體內(nèi)驗證PAR的致病性，研究人員建立了大鼠尾椎椎間盤PAR注射模型。MRI T2加權(quán)圖像分析顯示，PAR注射組表現(xiàn)出典型的退行性改變，表現(xiàn)為信號強度和椎間盤高度指數(shù)（DHI）顯著降低。組織學染色和評分進一步證實，PAR注射導致了椎間盤退變的病理變化，包括髓核組織減少、蛋白多糖嚴重丟失、纖維環(huán)結(jié)構(gòu)破壞以及組織學評分顯著增加。

總之，這些結(jié)果表明，機械壓力誘導的異常PAR積累是觸發(fā)髓核細胞PARthanatos的核心分子事件。同時，PAR也可能通過激活如Hippo通路等促退變信號通路，促進和加速椎間盤退變的病理過程。

為闡明機械壓力下PAR異常積累的上游機制，研究人員首先檢測了參與PAR代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的蛋白表達。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，壓力作用下PAR水平呈時間依賴性顯著增加，而PARG的蛋白表達相應下降。值得注意的是，另一種PAR水解酶ARH3的蛋白水平基本保持不變。

功能拯救實驗表明，過表達PARG能顯著逆轉(zhuǎn)壓力誘導的細胞死亡，而過表達ARH3則無保護作用。一致地，過表達PARG有效減少了壓力誘導的PAR積累，而過表達ARH3沒有顯著影響。為區(qū)分這兩種酶的作用，進行了基因敲低實驗。結(jié)果顯示，敲低PARG在基礎(chǔ)條件下顯著加劇了PAR積累，而敲低ARH3對PAR水平?jīng)]有明顯影響。這些發(fā)現(xiàn)表明，在髓核細胞中，PARG是負責PAR降解的主導酶，而非ARH3，突顯了細胞類型特異性的調(diào)控機制。

值得注意的是，過表達PARG顯著抑制了PARthanatos的執(zhí)行，表現(xiàn)為PAR、AIF和MIF水平降低，以及AIF和MIF的核轉(zhuǎn)位減少。同時，它還阻止了壓力誘導的NAD⁺/NADH比率的下降。對從人類椎間盤中分離的蛋白質(zhì)的分析顯示，與健康椎間盤組織相比，退變椎間盤組織中的PARG蛋白表達水平顯著降低。這些結(jié)果進一步確立了PARG是維持髓核細胞PAR代謝穩(wěn)態(tài)的核心分子，并表明其異常下調(diào)是機械壓力誘導PARthanatos的關(guān)鍵觸發(fā)因素。

盡管PARG蛋白水平顯著下降，但其mRNA表達在壓力后保持不變，提示存在翻譯后調(diào)控。研究人員隨后用蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑氯喹處理髓核細胞。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，MG132處理有效抑制了壓力誘導的PAR積累，而氯喹沒有這種效果，表明PARG降解主要由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導。因此，研究人員提出，機械壓力通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)特異性促進PARG（而非ARH3）的泛素化和降解，從而破壞PAR穩(wěn)態(tài)，導致其毒性積累并最終觸發(fā)PARthanatos。

為進一步證實PARG的泛素化，研究人員在過表達Flag-PARG的髓核細胞中進行了免疫共沉淀實驗。結(jié)果表明，在機械壓力作用下，與PARG結(jié)合的泛素水平隨時間逐漸增加，證實了壓力誘導的PARG泛素化。MG132減輕了機械壓力誘導的PAR水平增加，而PARG抑制劑COH34抵消了MG132的這種效應。此外，MG132以劑量依賴的方式緩解了壓力誘導的PAR積累。免疫共沉淀實驗也表明，MG132處理提高了PARG的水平，證明壓力通過促進PARG的泛素化和隨后的蛋白酶體降解，導致其功能喪失和PAR代謝失調(diào)。

基于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的作用，研究人員接下來試圖確定介導PARG降解的關(guān)鍵分子。對PARG進行免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析顯示，在所有潛在的互作蛋白中，TRIM25表現(xiàn)出最顯著的結(jié)合。免疫共沉淀實驗進一步證實了TRIM25與PARG之間的相互作用，并且在壓力作用下這種相互作用增強。

免疫熒光染色顯示，PARG分布在細胞核和細胞質(zhì)中，這與定位于不同區(qū)室的交替剪接異構(gòu)體的表達一致。為驗證PARG異構(gòu)體的特異性亞細胞分布，研究人員進行了核質(zhì)分離實驗。結(jié)果顯示，全長PARG異構(gòu)體富集于細胞核，而較短的異構(gòu)體主要定位于細胞質(zhì)。重要的是，TRIM25主要定位于細胞質(zhì)，并在那里與這些胞質(zhì)PARG異構(gòu)體顯著共定位。

為研究TRIM25是否調(diào)控PARG的穩(wěn)定性，首先檢測了其對PARG蛋白半衰期的影響。環(huán)己酰亞胺追蹤實驗表明，在TRIM25敲低的髓核細胞中，PARG的降解速率顯著減慢。相應地，TRIM25敲除有效逆轉(zhuǎn)了機械壓力誘導的PARG蛋白下調(diào)，為壓力誘導的PARG降解是由TRIM25驅(qū)動提供了直接的因果證據(jù)。相反，過表達TRIM25降低了PARG蛋白水平，這種效應可被MG132阻斷，表明TRIM25通過蛋白酶體途徑調(diào)控PARG降解。

接下來，研究人員解析了TRIM25-PARG相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。利用一系列TRIM25截短突變體，免疫共沉淀實驗揭示，只有包含RING結(jié)構(gòu)域的片段能與PARG結(jié)合，表明RING結(jié)構(gòu)域是相互作用所必需的。為驗證TRIM25的E3連接酶活性在此過程中的功能作用，研究人員生成了一個RING結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵催化位點突變體。功能實驗表明，過表達野生型TRIM25加速了PARG降解，而突變體則沒有這種效應。在TRIM25敲除細胞中重建野生型TRIM25促進了PAR積累，而重建突變體則沒有。重要的是，在機械壓力下，過表達野生型TRIM25顯著增強了PARG的泛素化并促進其降解，而過表達突變體則無影響。

為確定PARG上負責與TRIM25結(jié)合的區(qū)域，研究人員構(gòu)建了N端和C端截短的PARG突變體。結(jié)果表明，全長PARG和N端片段能與TRIM25結(jié)合，而C端片段則不能，提示TRIM25特異性識別PARG的N端區(qū)域。為精確定位負責此相互作用的特定氨基酸殘基，研究人員進一步生成了PARG點突變體，包括K115A和K451A。免疫共沉淀實驗證明，K115A突變完全消除了與TRIM25的相互作用，而K451A突變體保留了結(jié)合能力。這些發(fā)現(xiàn)明確地將賴氨酸115確定為TRIM25泛素化PARG的關(guān)鍵位點。

總之，在機械壓力下，TRIM25通過其RING結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合PARG N端區(qū)域的賴氨酸115位點，并促進PARG的泛素化和蛋白酶體降解，最終導致髓核細胞中PAR代謝失調(diào)。

鑒于TRIM25在多種病理模型中對DNA損傷的既定作用，有必要進一步闡明其在壓力下DNA損傷中的作用。研究人員首先檢測了壓力下TRIM25的表達模式。RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析的一致結(jié)果顯示，機械壓力在mRNA和蛋白水平上均誘導了TRIM25顯著且呈時間依賴性的上調(diào)，確立了TRIM25為一個關(guān)鍵的機械壓力響應基因。

為闡明導致這種誘導的上游機械轉(zhuǎn)導信號，研究人員探究了細胞內(nèi)鈣內(nèi)流的作用。研究發(fā)現(xiàn)，特異性鈣螯合劑BAPTA-AM有效消除了壓力誘導的TRIM25上調(diào)，表明機械壓力通過鈣依賴性信號通路觸發(fā)TRIM25表達。為評估TRIM25對DNA損傷的影響，研究人員通過彗星實驗和γ-H2AX檢測評估了其功能獲得和功能喪失的影響。結(jié)果表明，敲低TRIM25顯著減輕了機械壓力誘導的DNA損傷，而過表達TRIM25則加劇了DNA損傷。

基于先前的報道，研究人員假設(shè)TRIM25可能通過調(diào)控DNA修復蛋白Ku80的穩(wěn)定性來影響DNA損傷水平。值得注意的是，機械壓力降低了Ku80蛋白水平，而這一效應可被TRIM25敲低所逆轉(zhuǎn)。環(huán)己酰亞胺追蹤實驗進一步證實，過表達TRIM25顯著加速了Ku80蛋白的降解。從機制上講，免疫共沉淀實驗顯示，機械壓力增強了TRIM25與Ku80之間的相互作用及其在髓核細胞內(nèi)的共定位，提示TRIM25可能作為E3泛素連接酶靶向Ku80。

為驗證TRIM25介導的Ku80耗竭對DNA修復能力的功能影響，研究人員評估了細胞在DSB誘導劑依托泊苷處理下的存活情況。過表達TRIM25的細胞表現(xiàn)出活力顯著降低和對依托泊苷的超敏性，表明非同源末端連接（NHEJ）通路受損。為驗證這種功能關(guān)系，進行了一系列拯救實驗。過表達Ku80有效減輕了髓核細胞中壓力誘導的DNA損傷，而這種保護作用被共過表達TRIM25完全抵消。進一步的確認顯示，過表達TRIM25降低了Ku80蛋白水平并增加了γ-H2AX表達，兩者均可被共表達Ku80所挽救。此外，過表達Ku80也減輕了壓力誘導的PAR積累，而這種效應同樣被TRIM25過表達所逆轉(zhuǎn)，表明TRIM25部分通過降解Ku80并加劇DNA損傷反應來促進PARthanatos。

另外，研究人員調(diào)查了TRIM25的臨床相關(guān)性。結(jié)果顯示，與健康對照組相比，TRIM25在人類退變椎間盤中的表達顯著更高，且與退變嚴重程度呈正相關(guān)，強調(diào)了TRIM25在椎間盤退變病理生理學中的關(guān)鍵作用�？傊�，TRIM25的上調(diào)不僅通過降解PARG誘導PARthanatos，還通過促進Ku80降解損害DNA損傷修復能力，從而在壓力下加劇基因組不穩(wěn)定性和異常的PAR積累。

為評估TRIM25敲低在機械壓力下的保護作用，研究人員首先評估了TRIM25調(diào)控對髓核細胞活力的整體影響。盡管Z-VAD/Nec-1聯(lián)合處理部分緩解了壓力誘導的細胞死亡，但聯(lián)合TRIM25敲低產(chǎn)生了更強的保護效應，表明TRIM25主要調(diào)控一條不依賴Caspase和MLKL的細胞死亡通路。

蛋白質(zhì)印跡分析顯示，TRIM25敲低有效抑制了機械壓力誘導的PAR積累以及AIF和MIF表達的上調(diào)。核質(zhì)分離實驗進一步證明，TRIM25敲低阻止了MIF的核轉(zhuǎn)位。與這些發(fā)現(xiàn)一致，免疫熒光染色顯示，TRIM25敲低顯著降低了PAR水平，減少了AIF和MIF的表達，并減弱了AIF和MIF的核定位。此外，TRIM25敲低改善了壓力誘導的NAD⁺/NADH比率的下降，這可能是由于PAR代謝效率提高所致。

對受壓髓核細胞的KEGG通路分析表明，RIG-I樣受體信號通路被顯著激活。研究人員隨后驗證了RIG-I表達在壓力處理后呈時間依賴性增加。鑒于先前報道的TRIM25的免疫調(diào)節(jié)功能，研究人員假設(shè)它可能參與了這一過程。進一步的實驗證實，機械壓力上調(diào)了髓核細胞中多種炎癥因子的表達，而敲低TRIM25或RIG-I有效抑制了這些炎癥因子的細胞水平。為驗證這些因子是否主動分泌到微環(huán)境中，研究人員使用ELISA分析了細胞培養(yǎng)上清液。正如預期，機械壓力導致TNF、IL1B、IL-6和IL-8的細胞外濃度急劇增加。重要的是，敲低TRIM25和RIG-I顯著抑制了這種分泌高峰。壓力還顯著增加了IFNB1 mRNA水平和IFN-β的分泌，而敲低TRIM25或RIG-I有效逆轉(zhuǎn)了這些變化。此外，壓力增強了TRIM25和RIG-I之間的蛋白相互作用和細胞內(nèi)共定位。

這表明，在壓力下，升高的TRIM25也通過激活RIG-I信號通路促進炎癥反應。免疫共沉淀實驗證實，在壓力下，TRIM25和RIG-I之間的相互作用增強。因此，除了其在促進PAR毒性和PARthanatos中的作用外，TRIM25的上調(diào)還通過激活RIG-I通路加劇炎癥。敲低TRIM25同時減弱了細胞死亡和炎癥反應，顯著提高了髓核細胞在機械壓力下的存活率。

值得注意的是，鑒于觀察到的DNA損傷積累和炎癥因子釋放，研究人員進一步探討了TRIM25在細胞衰老中的潛在作用。結(jié)果顯示，機械壓力顯著上調(diào)了衰老標志物的表達并增加了SA-β-gal活性，而敲低TRIM25有效逆轉(zhuǎn)了這些效應。盡管這與上述急性細胞死亡途徑不同，但這些發(fā)現(xiàn)提示TRIM25可能通過橋接DNA損傷反應和炎癥微環(huán)境，同時驅(qū)動髓核細胞衰老，從而通過多種機制加速椎間盤退變。這一潛在的TRIM25-衰老軸為未來的機制研究提供了引人入勝的方向。

為驗證TRIM25-PARG軸的病理意義和治療潛力，研究人員在大鼠尾椎建立了機械壓力誘導的椎間盤退變模型。通過克氏針和加壓彈簧施加機械壓力，并通過局部慢病毒注射進行相應干預。

8周后，T2加權(quán)MRI圖像顯示，壓力組的椎間盤信號強度和水含量顯著降低，表明發(fā)生了椎間盤退變。相比之下，聯(lián)合sh-TRIM25慢病毒治療顯著恢復了椎間盤信號強度。組織病理學檢查進一步證明，機械壓力導致髓核結(jié)構(gòu)破壞、蛋白多糖丟失和膠原結(jié)構(gòu)紊亂。這些病理變化在sh-TRIM25治療組中顯著改善，表明TRIM25敲低減輕了大鼠壓力誘導的椎間盤退變。一致地，免疫熒光分析顯示，機械壓力導致膠原蛋白II和聚集蛋白聚糖大量丟失，證實了基質(zhì)降解；然而，sh-TRIM25治療有效地保留了這些成分。

免疫熒光染色顯示，在受壓椎間盤中PAR、AIF和MIF水平升高，同時PARG表達降低，IL1B積累增加，證實了在機械負荷下PARthanatos和炎癥的激活。然而，sh-TRIM25治療有效逆轉(zhuǎn)了這些分子變化，在體內(nèi)抑制了PARthanatos激活和炎癥反應。

研究人員進一步評估了PARG過表達的治療效果。MRI分析表明，慢病毒介導的PARG過表達減輕了壓力誘導的椎間盤退變的嚴重程度。組織學染色顯示，PARG過表達組椎間盤結(jié)構(gòu)保存更好，蛋白多糖含量更高，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)更有序。定量評估證實，PARG過表達后Pfirrmann分級、椎間盤高度指數(shù)和組織學評分均有顯著改善。類似地，雖然機械壓力消耗了基質(zhì)蛋白，但PARG過表達顯著恢復了膠原蛋白II和聚集蛋白聚糖的熒光強度。免疫熒光分析進一步證實，PARG過表達抑制了機械壓力誘導的PAR積累和PARthanatos激活。

總之，體內(nèi)的研究結(jié)果表明，沉默TRIM25或過表達PARG都能通過抑制PAR積累和PARthanatos激活，有效減輕機械壓力誘導的椎間盤退變。這些結(jié)果不僅證實了TRIM25-PARG通路在壓力誘導椎間盤退變中的核心作用，也突出了其作為治療靶點的潛力。