《Advanced Science》：TGM2 Aggravates Acute Pancreatitis by Impairing Macrophage Efferocytosis Through Inhibition of the STAT6–GAS6 Axis
編輯推薦：
本文聚焦急性胰腺炎（AP）的炎癥調控新機制，通過多組學分析、細胞與動物實驗驗證，首次揭示了轉谷氨酰胺酶2（TGM2）通過與信號轉導和轉錄激活因子6（STAT6）相互作用，抑制其磷酸化與核轉位，從而下調胞葬作用關鍵分子生長停滯特異性蛋白6（GAS6）的表達，損害巨噬細胞清除凋亡細胞功能，最終加劇AP炎癥與組織損傷。研究進一步構建了乳鐵蛋白修飾的ROS響應型脂質納米粒（LF-LNP@si-TGM2），實現了對胰腺巨噬細胞中TGM2的特異性沉默，為AP的精準靶向治療提供了新策略。
背景
急性胰腺炎（AP）是全球范圍內常見的急腹癥，其嚴重形式（SAP）死亡率高達20-30%。AP發病由腺泡細胞內胰酶異常激活引發，導致細胞損傷并級聯放大局部與全身炎癥反應。當前臨床管理以支持治療為主，針對疾病核心進展機制的靶向干預手段仍十分缺乏。巨噬細胞在AP炎癥微環境中扮演雙重角色，既是促炎因子的生產者，也是負責清除死亡細胞與碎片（即胞葬作用）的專業清除細胞。胞葬作用缺陷可導致凋亡細胞堆積和繼發性壞死，加劇損傷相關分子模式釋放，是AP向重癥發展的重要驅動因素。因此，靶向巨噬細胞功能、恢復其胞葬能力，是緩解AP炎癥、促進消退的潛在策略。
TGM2：多組學篩選鑒定的AP核心靶點
通過整合公開數據庫的批量轉錄組與單細胞RNA測序數據，并結合機器學習算法，研究團隊從AP患者數據中篩選出與疾病風險顯著相關的潛在調控分子。孟德爾隨機化分析與轉錄組差異表達譜交叉驗證，從105個AP風險相關蛋白中鎖定出12個關鍵分子。進一步通過支持向量機遞歸特征消除與隨機森林模型進行重要性排序，轉谷氨酰胺酶2（TGM2）被兩個模型共同鑒定為AP的特征基因。蛋白互作網絡分析顯示TGM2處于互作網絡的核心節點，提示其可能在AP相關信號網絡中扮演關鍵調控角色。免疫浸潤分析表明，胰腺組織中TGM2表達與單核細胞、M1型巨噬細胞的浸潤評分呈正相關，而與CD8+T細胞、調節性T細胞的浸潤評分負相關，暗示其可能與促炎特性相關。
TGM2在AP中上調并促進疾病進展
在雨蛙素誘導的AP小鼠模型中，胰腺損傷明顯，炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表達及血清淀粉酶活性顯著升高。與此同時，TGM2在AP小鼠胰腺組織中的mRNA和蛋白水平均顯著上調。免疫熒光染色證實，TGM2在AP胰腺組織中高表達。在重癥AP模型中，TGM2表達同樣顯著增加。為驗證TGM2的功能，在AP造模前使用其抑制劑胱胺進行預處理，可有效抑制胰腺組織中TGM2的表達。組織病理學染色顯示，胱胺預處理能顯著減輕AP小鼠的胰腺損傷，降低胰腺局部及全身循環中的炎癥因子水平。在重癥AP模型中，胱胺同樣減輕了炎癥。這些結果表明，TGM2在AP中表達上調，并促進了局部和全身的炎癥反應，加劇了胰腺損傷。
TGM2促進AP中的巨噬細胞炎癥
為探究TGM2加劇AP的潛在機制，研究分析了公開的單細胞RNA測序數據集。在AP小鼠胰腺組織中，中性粒細胞和巨噬細胞浸潤顯著增加，且TGM2主要在這兩類細胞中表達，其在AP組織中的表達水平顯著高于正常對照。進一步的亞群分析顯示，TGM2+巨噬細胞中，胞葬作用相關通路顯著富集。體內實驗通過免疫熒光和流式細胞術證實，AP和重癥AP小鼠胰腺組織中，巨噬細胞（F4/80+）及其TGM2+亞群比例均顯著增加。
體外實驗通過用AP條件培養基刺激巨噬細胞RAW264.7，模擬AP微環境。結果發現，TGM2的mRNA和蛋白水平顯著上調，同時促炎細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和M1型巨噬細胞標志物CD86表達增加。當在巨噬細胞中敲低TGM2或使用其抑制劑后，AP條件培養基誘導的促炎因子和CD86高表達被顯著抑制，而抗炎因子IL-10和M2型標志物CD206的表達則升高。這表明TGM2在AP模型中促進了巨噬細胞的炎癥反應并驅動其向M1表型極化。
TGM2通過抑制GAS6依賴性巨噬細胞胞葬作用加重AP
對TGM2+與TGM2-巨噬細胞的差異基因分析顯示，胞葬作用關鍵分子生長停滯特異性蛋白6（GAS6）在TGM2+巨噬細胞中表達顯著下調。體外實驗中，AP條件培養基刺激導致巨噬細胞GAS6表達降低，而敲低TGM2則可顯著恢復GAS6的表達。胞葬功能檢測表明，AP條件培養基刺激會顯著損害巨噬細胞對凋亡腺泡細胞的吞噬能力，而TGM2敲低可逆轉這種抑制，恢復巨噬細胞的胞葬功能。體內透射電鏡和免疫熒光結果也證實，抑制TGM2可增強AP小鼠胰腺組織中的胞葬活動。
為明確GAS6在TGM2調控胞葬中的作用，研究同時敲低了巨噬細胞中的TGM2和GAS6。結果顯示，GAS6沉默逆轉了TGM2敲低所帶來的胞葬功能改善。同時，GAS6敲低也逆轉了TGM2敲低對巨噬細胞炎癥表型的調節作用。在動物模型中，同時抑制TGM2和GAS6，GAS6的抑制抵消了TGM2抑制所帶來的胰腺組織保護、炎癥減輕及胞葬增強效應。在重癥AP模型中也觀察到了類似結果。這些發現表明，TGM2通過下調GAS6的表達，損害巨噬細胞胞葬功能，從而加重AP的進展。
TGM2通過抑制STAT6磷酸化下調GAS6轉錄
既往研究表明，STAT6的磷酸化與核轉位是促進GAS6轉錄、緩解巨噬細胞介導炎癥的關鍵事件。本研究中，抑制STAT6磷酸化可導致巨噬細胞中GAS6的mRNA和蛋白水平顯著降低。雙熒光素酶報告基因和染色質免疫沉淀實驗證實，STAT6可直接結合GAS6基因啟動子并調控其轉錄活性。在AP條件培養基刺激的巨噬細胞中，總STAT6蛋白水平不變，但其磷酸化形式pSTAT6（Tyr641）的豐度顯著降低。值得注意的是，TGM2敲低可逆轉此效應，恢復pSTAT6（Tyr641）的水平，且此效應獨立于STAT6的上游分子pJAK1和pJAK3。
為闡明STAT6 Tyr641磷酸化在TGM2介導的巨噬細胞功能調控中的作用，研究在AP條件培養基刺激前，對巨噬細胞同時進行TGM2敲低和STAT6抑制或Tyr641位點突變。結果顯示，STAT6抑制或突變逆轉了TGM2敲低對巨噬細胞炎癥表型（下調IL-1β、IL-6、TNF-α、CD86，上調CD206）的調節作用，并廢除了TGM2敲低帶來的胞葬能力增強。
分子對接模擬預測了TGM2與STAT6之間潛在的結合界面，免疫共沉淀實驗驗證了兩者存在物理相互作用，且在AP背景下這種相互作用顯著增強。免疫熒光染色顯示，AP條件培養基促進了TGM2與STAT6的結合，并抑制了STAT6的核轉位，而TGM2敲低則恢復了STAT6的核定位。STAT6的Tyr641位點突變逆轉了上述現象。在動物模型中同時抑制TGM2和STAT6，STAT6抑制同樣抵消了TGM2抑制對AP的保護作用。多重免疫熒光染色進一步揭示，在AP模型胰腺組織的巨噬細胞中，STAT6與TGM2共定位且未進入細胞核。綜上，TGM2通過與STAT6相互作用，抑制其磷酸化與核轉位，進而下調GAS6的轉錄，這構成了TGM2關聯STAT6依賴性GAS6轉錄及胞葬功能損傷的機制。
構建LF-LNP@si-TGM2以增強巨噬細胞胞葬并緩解炎癥
為實現對靶點的精準干預，研究構建了乳鐵蛋白修飾的活性氧響應型載si-TGM2脂質納米粒（LF-LNP@si-TGM2）。該納米粒平均粒徑約156 nm，Zeta電位約8 mV，包封率達95.27%，形態呈球形。體外釋放實驗表明，其具有H2O2濃度依賴的ROS響應釋放特性。在AP條件培養基刺激的巨噬細胞中，LF-LNP@si-TGM2的攝取和FITC釋放顯著高于正常組。細胞內追蹤顯示，納米粒可被巨噬細胞內化并成功實現溶酶體逃逸。
功能上，LF-LNP@si-TGM2能更有效地降低AP條件誘導的巨噬細胞中TGM2的上調，并恢復pSTAT6和GAS6的表達。同時，它能顯著降低促炎因子和CD86的表達，并增強巨噬細胞的胞葬能力，其效果優于游離的si-TGM2。
LF-LNP@si-TGM2在AP小鼠體內增強胞葬并減輕疾病進展
體內生物安全性評估顯示，LF-LNP@si-TGM2未對小鼠主要臟器造成損傷，血清心肌酶、轉氨酶、肌酐、尿素氮水平無變化，體外溶血實驗也表明其具有良好的血液相容性。體內分布成像顯示，靜脈注射后，LF-LNP@si-TGM2主要在發炎的胰腺組織中蓄積。在AP小鼠模型中，LF-LNP@si-TGM2能有效降低胰腺組織TGM2表達，提升pSTAT6和GAS6水平，其效果與胱胺相當。組織病理學分析證實，LF-LNP@si-TGM2和胱胺均能減輕胰腺損傷，降低炎癥因子表達。透射電鏡和免疫熒光顯示，兩者均能增強胰腺組織中的胞葬活動，且LF-LNP@si-TGM2效果更優。在重癥AP模型中，LF-LNP@si-TGM2同樣展現出良好的治療效果。
結論
本研究首次揭示，TGM2通過直接結合STAT6抑制其磷酸化與核轉位，進而下調GAS6轉錄，損害巨噬細胞胞葬功能，最終加劇AP嚴重程度的分子機制，即“TGM2–STAT6–GAS6”調控軸。基于此，成功構建了可靶向胰腺巨噬細胞的ROS響應型納米遞送系統LF-LNP@si-TGM2。該系統通過沉默TGM2，恢復STAT6-GAS6信號軸，有效增強胞葬、減輕炎癥與組織損傷，為AP的精準靶向治療提供了新的分子靶點與技術策略。
