《Plant Biotechnology Journal》：Challenges in Bringing Pangenome Research Into Breeding: A Case Study in Rice
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本綜述聚焦水稻泛基因組研究在育種應(yīng)用中的前沿進(jìn)展與瓶頸。文章系統(tǒng)梳理了從單一參考基因組向泛基因組（pangenome）范式轉(zhuǎn)變所帶來的突破，尤其是結(jié)構(gòu)變異（SV）、存在/缺失變異（PAV）等新型遺傳標(biāo)記在解析產(chǎn)量、抗病及抗逆性狀“缺失遺傳力”中的關(guān)鍵作用。同時，作者深入剖析了將海量、復(fù)雜的泛基因組數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為育種者（breeder）可操作工具的現(xiàn)存障礙，包括圖結(jié)構(gòu)（graph-based）數(shù)據(jù)分析的計算挑戰(zhàn)、AI/ML模型整合的鴻溝以及基因分型平臺的局限，并提出了面向未來的整合多組學(xué)（multi-omics）與構(gòu)建“育種友好型”決策系統(tǒng)的解決方案，為作物育種進(jìn)入泛基因組時代描繪了路線圖。
引言
作物育種已邁入基因組學(xué)時代，但長期以來依賴單一參考基因組（single reference genome）的策略，極大地限制了對物種內(nèi)廣泛遺傳多樣性的認(rèn)知。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步和大量基因組組裝的完成，研究者發(fā)現(xiàn)，單一參考基因組遺漏了大量存在于不同栽培品種和野生近緣種之間的結(jié)構(gòu)變異（SV）、存在/缺失變異（PAV）以及新基因。在此背景下，泛基因組（pangenome）應(yīng)運而生，它整合了多個種質(zhì)（accession）的全部遺傳多樣性，包含了存在于所有個體中的核心基因（core genes）以及在一個或多個個體中缺失的非必需基因（dispensable genes），為我們提供了遠(yuǎn)超單一基因組的、關(guān)于作物遺傳的全面藍(lán)圖。
然而，盡管泛基因組在揭示隱藏的遺傳變異方面潛力巨大，但在將其大規(guī)模數(shù)據(jù)集應(yīng)用于實際育種項目之間，仍存在顯著鴻溝。這源于缺乏面向育種者的SV/PAV基因分型平臺、連接泛基因組與表型數(shù)據(jù)的集成分析流程，以及處理圖結(jié)構(gòu)泛基因組所需的充足計算資源和專業(yè)知識。本文將以作為全球半數(shù)以上人口主糧和禾本科基因組學(xué)模式物種的水稻為例，探討泛基因組在作物改良中的前景，回顧其促成的最新突破，并審視在泛基因組輔助育種成為常規(guī)手段之前必須解決的技術(shù)與實操挑戰(zhàn)。
水稻泛基因組連接基因組學(xué)與育種的承諾
近年來，水稻泛基因組研究進(jìn)展顯著，已發(fā)表超過10項相關(guān)研究。早期研究主要聚焦亞洲栽培稻，且僅限于少數(shù)代表性品種。隨著測序技術(shù)和計算方法的進(jìn)步，研究范圍已擴展至野生稻和非洲栽培稻。一個里程碑式的研究是利用3010份亞洲栽培稻種質(zhì)構(gòu)建了線性泛基因組，清晰劃分出九個亞群，為探索等位基因變異和指導(dǎo)未來育種策略提供了前所未有的分辨率框架。另一項標(biāo)志性研究則基于145個野生和栽培稻基因組構(gòu)建了圖結(jié)構(gòu)泛基因組，發(fā)現(xiàn)了3.87 Gb參考基因組中缺失的新序列，并鑒定了69,531個泛基因，其中19.74%是野生稻特有的、與抗病和環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的基因。這些發(fā)展標(biāo)志著水稻泛基因組研究已從線性參考基因組演變?yōu)閯討B(tài)的圖結(jié)構(gòu)框架，能夠捕獲數(shù)千份種質(zhì)中的SV和PAV。
將泛基因組數(shù)據(jù)整合到育種策略中，代表了水稻改良的范式轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng)依賴單一參考基因組的育種和關(guān)聯(lián)分析，常常會遺漏關(guān)鍵基因，尤其是參考基因組中不存在的基因，以及控制重要性狀的SV。相比之下，泛基因組方法囊括了核心基因和非必需基因，從而利用了更廣泛的遺傳變異譜。例如，對3010份亞洲稻種質(zhì)的泛基因組分析，發(fā)現(xiàn)了約268 Mb日本晴（Nipponbare）參考基因組中不存在的序列，揭示了12,465個新基因和19,721個非必需基因。后續(xù)研究進(jìn)一步將已知泛基因組擴展，當(dāng)納入野生稻近緣種時，共發(fā)現(xiàn)了879 Mb新序列和約19,000個新基因。因此，水稻泛基因組揭示了一個與抗病、抗逆、產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)的、先前隱藏的巨大等位基因庫，為育種者提供了寶貴的新靶點。
更重要的是，泛基因組參考可以與現(xiàn)代分子育種策略（如全基因組關(guān)聯(lián)研究GWAS和基因組選擇GS）相結(jié)合，使得PAV和SV能夠與SNP一起作為信息標(biāo)記，用于連接基因型與表型。因此，由SV控制的性狀可以被更有效地定位，并且候選基因可以在泛基因組中被識別。總體而言，水稻泛基因組提供了遺傳多樣性的整體視圖，能夠通過標(biāo)記輔助選擇和基于SV的基因組選擇實現(xiàn)更精確、高效的育種。
水稻泛基因組學(xué)在性狀發(fā)現(xiàn)上的突破
泛基因組學(xué)對作物改良的潛在影響是巨大的，這一點已被水稻育種中眾多的最新案例研究和應(yīng)用所證明。整合的泛基因組分析解鎖了許多重要的農(nóng)藝性狀，而這些性狀是傳統(tǒng)的單參考方法所無法檢測到的。
一個主要突破涉及產(chǎn)量和植株結(jié)構(gòu)新位點的發(fā)現(xiàn)。例如，利用12個基因組的水稻泛基因組參考，Wang等人對413份不同水稻種質(zhì)進(jìn)行了基于PAV的全基因組關(guān)聯(lián)分析，成功鑒定出了影響粒重和株高的因果結(jié)構(gòu)變異，而這些是單參考SNP全基因組關(guān)聯(lián)分析未能檢測到的。值得注意的是，一個位于第8號染色體上的株高新數(shù)量性狀基因座QTL，僅在泛基因組學(xué)分析中被發(fā)現(xiàn)，凸顯了其揭示影響關(guān)鍵產(chǎn)量成分的隱藏遺傳因素的能力。
同樣，泛基因組方法顯著增強了對水稻抗病基因的發(fā)掘。抗性位點通常成簇存在并表現(xiàn)出PAV多態(tài)性，這使得用單參考方法檢測它們變得困難。通過利用基于泛基因組的全基因組關(guān)聯(lián)分析，一項近期研究發(fā)現(xiàn)了74個與稻瘟病抗性相關(guān)的QTL，其中包括新的同時賦予穗瘟和葉瘟抗性的qPBR1和與已知廣譜抗性基因ptr共定位的qPBR12。在qPBR1內(nèi)，定位了六個候選基因，其中一個顯示出與增強稻瘟病抗性的強關(guān)聯(lián)。這種泛基因組驅(qū)動的方法不僅揭示了新的抗性位點，也重新確認(rèn)了已克隆的抗性基因（如Pi9、Pi5、Pid1和Pita），證明了基于泛基因組的方法在捕獲已知和新型抗病基因方面的能力。
此外，泛基因組學(xué)方法還揭示了水稻耐熱性的遺傳基礎(chǔ)。一項研究構(gòu)建了來自60個水稻品種的泛基因組，以鑒定與耐高溫相關(guān)的基因。該分析揭示了1141個僅存在于耐熱品種且參考基因組中沒有的基因；其中許多基因在熱脅迫下差異表達(dá)。通過將這些發(fā)現(xiàn)與已知的耐熱QTL相結(jié)合，研究人員從非參考區(qū)域定位了兩個強候選基因，為培育耐熱水稻品種提出了有前景的靶標(biāo)。
將泛基因組學(xué)洞見轉(zhuǎn)化為實用育種的關(guān)鍵障礙與潛在解決方案
然而，將這些概念驗證的成功轉(zhuǎn)化為常規(guī)育種策略，仍需進(jìn)一步努力以解決剩余的技術(shù)和后勤挑戰(zhàn)。主要障礙及一些可行的解決方案概述如下。
數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性限制了功能變異的發(fā)現(xiàn)
一個主要障礙是生成數(shù)據(jù)的巨大體量和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。例如，一個全面的水稻泛基因組可能包含數(shù)萬個可變基因和數(shù)百萬個SV，這使得提取基因組信息的洞見變得困難。大多數(shù)研究仍專注于雙等位基因變異，這很大程度上是由于短讀長測序技術(shù)的局限以及缺乏能夠處理復(fù)雜多等位基因變異的穩(wěn)健分析框架。串聯(lián)重復(fù)和其他復(fù)雜SV經(jīng)常代表性不足，因為它們的準(zhǔn)確檢測和解釋需要高質(zhì)量的基因組組裝、圖結(jié)構(gòu)參考和多組學(xué)整合。
優(yōu)先考慮功能等位基因需要的不僅僅是DNA序列，因為轉(zhuǎn)錄組指示基因活性，表觀基因組標(biāo)記提供染色質(zhì)背景和等位基因使用信息，而表型則將功能變異與性狀聯(lián)系起來。通過高通量分析流程系統(tǒng)地整合多組學(xué)數(shù)據(jù)與泛基因組，研究者可以從數(shù)十萬個多態(tài)性中篩選出直接構(gòu)成重要生物學(xué)功能或農(nóng)藝性狀的子集。例如，將發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄組與水稻泛基因組變異整合，對于揭示多等位基因變異的調(diào)控作用至關(guān)重要。在另一項研究中，基因組范圍的DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在水稻雜種及其親本中結(jié)合，鑒定出了與等位基因特異性表達(dá)以及分蘗數(shù)和生物量等表型性狀相關(guān)的差異甲基化區(qū)域，證明了表觀突變可以驅(qū)動與農(nóng)藝性能相關(guān)的可遺傳表達(dá)變化。
計算挑戰(zhàn)、新興資源及泛基因組表示標(biāo)準(zhǔn)化
水稻泛基因組分析面臨著巨大的計算和生物信息學(xué)復(fù)雜性。傳統(tǒng)的線性表示通常拼接新序列或?qū)⑺鼈儽硎緸楠毩⒌寞B連群，但常常缺乏位置背景。由于早期組裝和比對工具的限制，非參考序列在沒有錨定到統(tǒng)一基因組框架的情況下被添加，使得相對于已知基因和結(jié)構(gòu)特征的定位變得復(fù)雜。圖結(jié)構(gòu)的泛基因組表示通過更高保真度地解析結(jié)構(gòu)變異和復(fù)雜重排來緩解這些問題。然而，在圖結(jié)構(gòu)框架中用于讀段比對和變異識別的工具仍然不成熟。許多泛基因組計算工具最初是針對人類基因組數(shù)據(jù)集開發(fā)和基準(zhǔn)測試的，它們在植物基因組（通常更大、重復(fù)性更高、雜合度更大）上的性能仍然沒有得到很好的表征。
此外，許多育種項目缺乏管理此類復(fù)雜泛基因組數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)所需的高性能計算基礎(chǔ)設(shè)施和專業(yè)的生物信息學(xué)專業(yè)知識。雖然變異圖可以提高基因分型準(zhǔn)確性，但它們通常比線性參考方法需要多得多的計算資源，限制了其在大型、復(fù)雜植物基因組中的可擴展性。因此，迫切需要開發(fā)針對圖結(jié)構(gòu)泛基因組的可擴展、高效的軟件解決方案。新興工具如VRPG提供了有前景的解決方案，它將基于線性參考的坐標(biāo)投影與集成注釋相結(jié)合，并采用了專門為圖結(jié)構(gòu)泛基因組分析優(yōu)化的高級數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。
推進(jìn)基因分型平臺以捕獲復(fù)雜的泛基因組變異
另一個重大挑戰(zhàn)在于開發(fā)能夠適應(yīng)多樣變異類型和復(fù)雜基因組背景的基因分型解決方案。傳統(tǒng)的育種項目主要依賴基于單一參考基因組設(shè)計的SNP芯片或靶向標(biāo)記，但這些方法難以捕獲非參考的PAV和SV。在水稻中，RPGA檢測了從3K泛基因組中選出的超過8萬個SNP和PAV探針，使得全基因組關(guān)聯(lián)研究能夠發(fā)現(xiàn)對單參考分析不可見的位點。更近期，RSPVM在圖結(jié)構(gòu)泛基因組框架上編目了超過5400萬SNP、1100萬插入缺失和約18.5萬個PAV，極大地提高了在群體規(guī)模上對稀有和結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行基因分型的能力。
因此，向先進(jìn)的基因分型范式過渡，需要具有成本效益的高通量平臺，能夠準(zhǔn)確捕獲泛基因組范圍的多等位基因和結(jié)構(gòu)變異，同時與現(xiàn)有的育種數(shù)據(jù)庫和決策支持系統(tǒng)保持兼容。
泛基因組解讀中新興的AI方法：育種應(yīng)用的差距
盡管人工智能和機器學(xué)習(xí)為解讀復(fù)雜的泛基因組數(shù)據(jù)提供了變革性的潛力，但將這些方法整合到實際育種流程中仍然是一個重大缺口。最近的進(jìn)展表明，人工智能可以增強泛基因組中SV和PAV的檢測和基因分型，這些對于傳統(tǒng)的生物信息學(xué)方法通常具有挑戰(zhàn)性。例如，卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和其他深度學(xué)習(xí)模型已被整合到SV檢測流程中，提高了大型群體數(shù)據(jù)集中的敏感性和準(zhǔn)確性，使得構(gòu)建高分辨率泛SV圖譜成為可能。在基于標(biāo)記的基因組選擇方面，一項近期水稻研究表明，將SV與SNP結(jié)合，在87%的比較中提高了預(yù)測能力。
然而，將人工智能應(yīng)用于泛基因組輔助育種仍面臨幾個關(guān)鍵障礙。一個主要問題是對于育種者的可用性和可及性：大多數(shù)用于泛基因組分析的人工智能工具是為遺傳學(xué)家和生物信息學(xué)家設(shè)計的，而不是為育種者設(shè)計的。育種項目難以采用基于泛基因組的方法，因為缺乏直觀的、對育種者友好的界面和可視化平臺，以將復(fù)雜的圖結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為可操作的性狀和變異信息。同時，育種數(shù)據(jù)集（如田間試驗記錄、遙感圖像和譜系數(shù)據(jù)）存在于不同的孤島中，無法與基因組變異數(shù)據(jù)順暢整合。在模型可解釋性和信任度方面也存在擔(dān)憂。育種者需要透明和可解釋的模型來做出自信的選擇決策。然而，許多最先進(jìn)的人工智能模型，特別是深度學(xué)習(xí)架構(gòu)，是“黑箱”，很難理解預(yù)測是如何做出的，也很難在育種背景下驗證結(jié)果。
應(yīng)用泛基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化與組織挑戰(zhàn)
即使在鑒定出新的性狀相關(guān)基因之后，將這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)用到田間仍然存在重大的轉(zhuǎn)化和組織挑戰(zhàn)。將來自野生稻或未利用地方品種的有價值等位基因?qū)氲絻?yōu)良栽培品種中，通常需要多個世代，并且可能因連鎖累贅或育性降低等問題而復(fù)雜化。雖然傳統(tǒng)方法如標(biāo)記輔助回交被廣泛用于將性狀從野生背景轉(zhuǎn)移到栽培背景中，但基因組編輯技術(shù)提供了一個有前景的替代方案。
水稻泛基因組研究發(fā)現(xiàn)了有益的基因，特別是在馴化過程中丟失但仍保留在野生稻中的抗性位點。通過“超泛基因組指導(dǎo)”的基因組編輯策略利用這些發(fā)現(xiàn)，可以快速地將抗旱或抗病等理想性狀重新引入現(xiàn)代品種，有可能規(guī)避漫長的回交過程。然而，無論是傳統(tǒng)方法還是基因組編輯方法的實施都面臨障礙，包括對轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管限制，以及育種者和公眾對新技術(shù)接受度的需要。這些問題是作物改良計劃中普遍存在的。
結(jié)論、展望及對水稻和其他作物的啟示
將水稻泛基因組轉(zhuǎn)化為常規(guī)分子育種應(yīng)用正在穩(wěn)步推進(jìn)，盡管仍有若干挑戰(zhàn)有待克服。近期的概念驗證研究已經(jīng)證明了泛基因組學(xué)方法在鑒定傳統(tǒng)方法未能檢測到的性狀相關(guān)基因方面的能力。創(chuàng)新工具的發(fā)展，進(jìn)一步強化了這種方法對于功能基因組學(xué)和實際育種的變革潛力。總的來說，這些進(jìn)展表明，水稻泛基因組正在成為作物改良的有力工具。
展望未來，預(yù)計水稻育種者將常規(guī)使用泛基因組圖譜來選擇具有互補新基因內(nèi)容的親本系。他們將利用基于泛基因組的全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定從外緣供體導(dǎo)入的關(guān)鍵基因組區(qū)域，并咨詢廣泛的泛基因組數(shù)據(jù)庫以指導(dǎo)精確的基因編輯策略。最終，水稻泛基因組已從一個學(xué)術(shù)概念演變?yōu)橐粋�有望增強分子育種的實用資產(chǎn)。這種轉(zhuǎn)變?yōu)閺V泛的應(yīng)用提供了寶貴的經(jīng)驗和最佳實踐，表明泛基因組信息策略可以使水稻以外的多種作物受益。
