乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，其高發病率和死亡率對公共衛生構成重大挑戰。傳統的放療、化療及手術等療法雖有一定效果，但常伴隨諸多副作用和治療耐受性問題。銅死亡是一種新近發現的、與細胞內銅離子積累相關的細胞死亡方式。癌細胞通常表現出更高的氧化應激和代謝活性，使其對銅離子毒性更為敏感。銅離子載體Elesclomol能將胞外Cu²⁺結合并轉運至胞內。FDX1通過將Cu²⁺還原為Cu⁺，阻礙鐵硫簇(Fe-S cluster)蛋白的形成，并作為線粒體酶脂酰化的上游調節因子。Cu⁺與三羧酸(TCA)循環中脂酰化的二氫硫辛酰胺乙酰轉移酶(DLAT)結合，誘導脂酰化蛋白異常積累，最終引發蛋白質毒性應激和細胞死亡。然而，銅離子對腫瘤細胞缺乏特異性，也可能影響健康細胞，導致有害副作用和全身毒性。

光動力療法作為一種新型非侵入性治療手段，利用光激活局部照射腫瘤部位，可最大限度地減少對正常組織的傷害，提高治療的安全性和特異性。但PDT在治療乳腺癌時存在光敏劑選擇性差、光穿透深度有限以及代謝排泄困難等局限。將銅死亡與光動力療法相結合，可能代表一種新穎的癌癥治療策略。銅死亡誘導細胞內銅離子積累，引發細胞毒性和死亡，而PDT則通過特定波長激光激活光敏劑產生活性氧來殺死腫瘤細胞。銅離子誘導的氧化應激與PDT產生的ROS相結合，可產生協同效應，可能導致更強的細胞毒性和改善的治療效果。

脂質體是一種因其獨特的雙層膜結構和優異的生物相容性而廣泛用于腫瘤治療的納米級藥物載體。脂質體給藥技術可以提高藥物的穩定性和生物利用度，增強在腫瘤部位的靶向性，并減少治療副作用。本研究開發了一種利用脂質體遞送ICG和ES-Cu的方法，旨在實現乳腺癌治療中的光動力增敏與銅死亡。ICG是一種近紅外光敏劑，具有優異的光學特性和生物相容性，而ES-Cu則通過螯合銅離子誘導細胞死亡。將這兩種藥物封裝在脂質體中，有望提高它們在腫瘤組織中的穩定性和靶向性，改善治療效果，并最大限度地減少對正常組織的副作用。

研究使用了薄膜水化法制備了共載ICG與ES-Cu的納米藥物。將磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂(PC)、DSPE-PEG₂₀₀₀和膽固醇(Chol)以20:50:5:25的摩爾比與ES-Cu溶解于氯仿，并加入含ICG的PBS溶液，經超聲乳化、旋轉蒸發除去氯仿、離心過濾等步驟后，獲得ICG@ES-Cu Lip。通過透射電鏡觀察形態，動態光散射分析儀測定粒徑和Zeta電位。

使用人乳腺癌細胞系MCF-7進行體外實驗。通過CCK-8法、活/死細胞染色評估不同納米顆粒在有/無近紅外激光照射下的細胞毒性。使用JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位變化，谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)測定試劑盒評估氧化應激水平。通過DCFH-DA熒光探針結合熒光顯微鏡及流式細胞術檢測細胞內活性氧水平。

在體內實驗中，建立了MCF-7皮下荷瘤裸鼠模型，通過尾靜脈注射脂質體，并在腫瘤部位進行808 nm近紅外激光照射。監測腫瘤體積、小鼠體重變化，并通過HE染色評估腫瘤組織病理學改變。

透射電鏡圖像顯示，ICG@ES-Cu Lip形態均一，呈準球形。動態光散射結果顯示其平均粒徑為208.3 ± 1.07 nm，Zeta電位為-38.1 ± 1.01 mV。將脂質體置于DMEM培養基中4天，其粒徑未發生顯著變化，表明其具有良好的穩定性。

銅死亡過程會導致線粒體功能障礙，引起線粒體膜電位下降。JC-1染色結果顯示，與其它處理組相比，ICG@ES-Cu Lip聯合近紅外激光處理組綠色熒光顯著增強，紅色熒光明顯減弱，表明線粒體膜電位明顯升高。同時，該處理組的GSH水平顯著降低，而MDA水平持續升高，兩者呈負相關。qRT-PCR分析顯示，在ICG@ES-Cu Lip + NIR組中，銅死亡關鍵基因DLAT、NLP4、LIAS和FDX1的mRNA表達水平顯著下調。以上結果表明，PDT可以增強MCF-7細胞的銅死亡。

熒光顯微鏡和流式細胞術分析均表明，用ICG@ES-Cu Lip + NIR處理MCF-7細胞時，細胞內產生的活性氧水平最高，證實了PDT能增強銅死亡誘導的氧化應激。

CCK-8實驗表明，單獨使用ICG@ES-Cu Lip時，即使濃度增加，MCF-7細胞存活率也無顯著變化。但在相同功率的近紅外激光照射下，ICG@ES-Cu Lip與ICG@Lip的細胞毒性存在顯著差異，ICG@ES-Cu Lip + NIR組表現出最佳的抗腫瘤效果。活/死細胞染色實驗進一步證實，ICG@ES-Cu Lip + NIR處理引起了大量腫瘤細胞凋亡。這些結果表明，PDT能明顯增強銅死亡誘導的抗腫瘤作用。

通過測量腫瘤大小變化評估不同治療方案的效果。治療效果從低到高排序為：NC組 = ICG@Lip < ICG@ES-Cu Lip < ICG@Lip + NIR < ICG@ES-Cu Lip + NIR。ICG@ES-Cu Lip治療對抑制腫瘤生長的作用有限，而ICG@ES-Cu Lip + NIR治療組表現出顯著更強的腫瘤抑制效果。腫瘤組織的HE染色結果顯示，ICG@ES-Cu Lip + NIR組的腫瘤切片顯示顯著的組織結構改變，大量腫瘤細胞壞死，細胞核消失，胞質明顯變性崩解，表明PDT與銅死亡聯合治療引發了強烈的細胞殺傷效應。此外，通過監測荷瘤小鼠體重，所有治療組均未觀察到顯著變化，表明ICG@ES-Cu Lip + NIR療法具有良好的生物安全性。綜合機制示意圖表明，該脂質體靜脈注射后靶向腫瘤，被細胞內化后在溶酶體中釋放Cu²⁺、ES和ICG。近紅外光激發ICG產生活性氧，與Cu⁺協同破壞線粒體代謝，通過抑制FDX1、破壞Fe-S簇并阻斷DLAT介導的脂酰化途徑，誘導腫瘤細胞發生銅死亡。

聯合療法在近年來在乳腺癌治療中顯示出顯著優勢，可以解決單一療法的局限性并減輕耐藥性。銅死亡作為一種新型抗癌策略，通過螯合銅離子誘導細胞凋亡和壞死，在多種癌癥類型中顯示出顯著的抗腫瘤作用。然而，單獨使用銅離子的治療效果受限于其在體內的釋放動力學和生物活性。光動力療法通過激活光敏劑產生活性氧來殺死腫瘤細胞，但由于乳腺癌腫瘤微環境的缺氧和高GSH狀態，單一的PDT效果不佳。本研究制備的脂質體納米藥物ICG@ES-Cu Lip，用于在體內外模型中評估聯合PDT和銅死亡用于乳腺癌治療的潛力。

研究采用多種方法評估PDT增強細胞銅死亡的能力。JC-1試劑通過測量線粒體膜電位變化，間接反映了細胞內銅離子誘導的線粒體膜損傷和細胞死亡。MDA是脂質過氧化的標志物，其水平升高間接證明了銅死亡的發生。GSH作為關鍵的抗氧化劑，其耗竭是氧化應激的標志。實驗結果顯示，ICG@ES-Cu Lip聯合NIR能產生最高的MDA水平并顯著降低GSH水平，表明PDT能顯著增強ES-Cu誘導的銅死亡。此外，銅死亡相關標志物（FDX1、DLAT、LIAS）的mRNA表達水平變化也證實了這一點。

研究還探討了PDT增強銅死亡的潛在機制。PDT通過產生活性氧誘導腫瘤細胞損傷和死亡。Elesclomol誘導氧化應激并破壞正常的細胞代謝過程。實驗結果表明，ES-Cu與PDT的聯合治療顯著提高了腫瘤細胞內的活性氧水平。因此，研究者提出，PDT通過增加活性氧的產生，進一步放大了ES-Cu觸發的細胞內氧化應激反應，從而增強了銅誘導的細胞死亡。

在體外毒性評估中，活死染色和CCK-8的實驗發現，在相同ICG濃度下，ICG@Lip + NIR比單獨PDT或ES-Cu治療顯示出更高的毒性。體內抗腫瘤實驗結果表明，ICG@Lip + NIR治療組僅能輕微減緩腫瘤生長，說明單獨PDT抑制腫瘤生長的效果有限。ICG@ES-Cu Lip也不能顯著抑制腫瘤增殖，說明誘導腫瘤細胞銅死亡的抗腫瘤效果也有限。而ICG@ES-Cu Lip + NIR治療組的腫瘤抑制效果遠高于其他組，表明銅死亡與PDT的聯合治療在抑制腫瘤發展方面具有顯著的協同效應。同時，通過監測荷瘤小鼠體重，實驗動物未出現劇烈體重變化，表明ICG@ES-Cu Lip + NIR療法具有良好的生物安全性。

總之，本研究探索了結合銅死亡策略與PDT，利用脂質體共遞送ICG和ES-Cu，對乳腺癌細胞產生的雙重打擊效應。實驗結果表明，PDT通過增加活性氧的產生，顯著增強了ES-Cu在腫瘤細胞中誘導的銅死亡效應。具體而言，聯合治療顯著提高了細胞內活性氧水平和銅離子積累，導致更高的腫瘤細胞死亡率。這種協同效應為乳腺癌提供了一種具有巨大實際應用潛力的新治療途徑。