《Journal of Virology》：Viral genome editing methods and applications in the CRISPR era
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本篇綜述系統性闡述了CRISPR-Cas系統在大型DNA病毒基因組精準編輯中的方法學框架與應用價值，為替代或補充傳統BAC重組技術提供了（NHEJ/HDR）等多種策略，其中心思想在于通過優化sgRNA設計、供體模板、遞送方式與HDR促進策略，實現對（HSV-1/HCMV）等病毒臨床分離株的直接、無痕（scarless）編輯，從而推動病毒功能基因組學、抗病毒靶點發現與轉化病毒學的發展。
在病毒學研究領域，大型DNA病毒（如皰疹病毒、腺病毒、痘病毒）因其龐大的基因組（通常100-300 kb）和復雜的調控區域，長期以來對其基因組進行精準操作面臨巨大技術挑戰。在可編程核酸酶出現之前，病毒基因組工程主要依賴體外重組或細菌人工染色體（BAC）克隆系統。盡管基于BAC的方法已成為多種皰疹病毒功能研究的金標準，但它們通常費時費力，經常需要互補細胞系和復雜的選擇程序，并且其應用受限于已建立BAC克隆的病毒株。更重要的是，無痕編輯需要額外步驟，且殘留的BAC序列通常需要被清除以恢復真實的病毒基因組。相比之下，CRISPR-Cas系統提供了一個更直接、更通用的平臺。向導RNA和Cas核酸酶足以在感染細胞內引入靶向DNA切割，從而無需BAC中間體即可實現對病毒基因組的精準修飾。
CRISPR-CAS介導的基因組編輯
CRISPR-Cas系統的核心在于，向導RNA與靶序列雜交，并引導Cas9、Cas12或Cas13等核酸酶至特定位點，導致目標核酸的切割和后續修飾。其中，Cas9和Cas12靶向DNA，而Cas13作用于RNA。本綜述主要關注DNA病毒基因組編輯。最廣泛使用的核酸酶是化膿鏈球菌Cas9（SpCas9），它能在單鏈向導RNA（sgRNA）定義的DNA位點引入雙鏈斷裂（DSB）。在真核細胞中，這種斷裂主要通過非同源末端連接（NHEJ）或微同源介導的末端連接（MMEJ）進行修復，通常導致插入或缺失（indels）和功能喪失性突變。然而，當存在供體模板時，同源定向修復（HDR）可以實現精確的序列整合。這種雙重修復潛力使得CRISPR能夠介導基因敲除和精確的基因敲入（包括單核苷酸替換和標簽插入）。此外，避免DSB形成的變體，如產生位點特異性單鏈切口的Cas9切口酶（nCas9）、與轉錄效應因子融合用于基因抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa）的催化失活Cas9（dCas9），以及像CasMINI這樣的超緊湊核酸酶，進一步擴展了系統的多功能性。
利用CRISPR-CAS9進行DNA病毒基因編輯
過去十年，CRISPR-Cas9的應用范圍已迅速擴展到包括DNA病毒甚至RNA病毒的整合DNA中間體。病毒學中的主要應用包括抗病毒策略開發、病毒決定因素的功能研究以及疫苗載體的工程化。雖然基本原理與宿主基因組編輯相似，但病毒系統提供了獨特的機遇和挑戰。在裂解期，病毒基因組大量復制，增加了編輯事件的可能性。細胞核內的病毒復制區室提供了富含病毒蛋白和宿主DNA修復因子的局部環境，創造了有利于CRISPR介導的編輯的條件。同時，病毒基因組編輯對實驗時機敏感。感染階段、感染復數（MOI）以及Cas9和供體模板的遞送時機強烈影響編輯結果。病毒基因組的高拷貝數也增加了同一基因座被重復切割的風險，可能導致漸進性的大片段缺失或意外重排。為了最大限度地減少這些事件，供體構建體可以設計在PAM或種子區引入沉默突變以防止再切割。本部分通過一個表格匯總了在單純皰疹病毒1型（HSV-1）、人巨細胞病毒（HCMV）、水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）、鴨腸炎病毒（DEV）、馬立克氏病病毒（MDV）、偽狂犬病病毒（PRV）、火雞皰疹病毒、EB病毒（EBV）、卡波西肉瘤相關皰疹病毒（KSHV）、乙型肝炎病毒（HBV）、JC多瘤病毒、人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）、人乳頭瘤病毒（HPV）和痘苗病毒（VACV）等多種病毒中，針對不同靶基因（如gE、UL23、ICP0、US34、IE1等）進行基因敲除、報告基因（如EGFP、TdTomato）敲入或疫苗株修飾的代表性研究，所采用的編輯策略（HDR或NHEJ）以及CRISPR組分的遞送方式。
高效基因組編輯的考量
高效的基因組編輯最終取決于將DNA修復導向所需途徑。由于NHEJ在大多數細胞環境中都很活躍，基因敲除通常可以通過相對簡單的設計決策實現，盡管由此產生的indels是隨機的且限制了精確性。相比之下，基于HDR的敲入允許精確的序列改變，但其操作窗口條件較窄。性能取決于核酸酶特性、供體格式和長度、鏈偏好、切割到編輯的距離、防止再切割的沉默突變、遞送方法和時機，以及在某種情況下的小分子調節。
選擇CRISPR-CAS蛋白
核酸酶的選擇應基于編輯目標、靶位點附近PAM序列的可用性以及切割位點的特性。SpCas9通常是首選。然而，Cas12家族成員，特別是像Cas12f這樣的緊湊型核酸酶，在PAM序列有限、需要多重編輯或載體容量受限時，可以作為有用的替代方案。Cas12a（Cpf1）識別富含T的PAM序列，并在PAM遠端切割位點產生交錯的5‘突出端，當NGG PAM稀缺或需要同時破壞多個基因座時具有優勢。Cas12f是一種小型核酸酶，其緊湊的尺寸使其能夠包裝到腺相關病毒（AAV）載體中。
選擇SGRNA
設計sgRNA需要在靶向活性、脫靶風險以及切割位置相對于所需編輯的位置之間取得平衡。對于敲除，主要目標是確保穩健的切割。對于敲入，切割必須仔細定位在預期修飾位點附近，并且供體設計必須包含在HDR后防止再切割的沉默突變。
供體模板
精確的敲入或替換需要在HDR窗口期間存在供體模板。供體類型、遞送方法和同源臂設計取決于細胞類型、感染模型和插入片段大小。供體格式包括：用于SNP或短插入等小編輯的單鏈寡脫氧核苷酸（ssODN）或長單鏈DNA（lssDNA）；適用于較大插入的線性雙鏈DNA/質粒雙鏈DNA；在許多細胞類型中提供高敲入效率的AAV；以及支持更大盒式片段遞送的整合缺陷型慢病毒載體（IDLV）。無論供體類型如何，都應引入沉默的PAM/種子區突變以防止HDR后的再切割。同源臂的長度因供體格式而異，對于ssODN，每臂通常為30-60 nt；對于lssDNA，每臂約為150-400 nt；對于線性雙鏈DNA/質粒，每臂300-800 bp是常見的。
CRISPR組分的遞送方法
在病毒基因組編輯中，高效的遞送通常是限速步驟。對于基于HDR的敲入，Cas核酸酶、sgRNA、供體模板和病毒基因組必須在HDR窗口期間共存于同一個細胞和細胞核內。每種遞送方法也對其可容納的CRISPR組分形式施加了限制。重組最活躍的時間是在切割后不久；因此，供體應在該時間達到核內濃度峰值。共遞送RNP和供體通過電穿孔可以使切割起始與供體可用性同步，并縮短核酸酶暴露時間，通常能減少脫靶效應和再切割。遞送方法主要包括：
- 1.
轉染：脂質體轉染是最簡單、可重復性最高的遞送方法之一，特別適用于HEK293、HeLa或Vero等許可細胞系。
- 2.
電穿孔：是轉染困難細胞（包括原代細胞、單核細胞、CD34+造血祖細胞和懸浮細胞系）最通用、最有效的方法。它特別適用于遞送Cas9 RNP。
- 3.
病毒載體：整合慢病毒支持Cas9/sgRNA的長期表達，適用于篩選或需要持續活性的系統。IDLV提供瞬時表達，廣泛用于供體遞送。rAAV已成為精確敲入的金標準供體載體。
增強HDR的小分子
細胞主要通過NHEJ修復DSB，而HDR僅限于細胞周期的S期和G2期。在宿主基因組編輯中，細胞周期調節劑如諾考達唑、長春花堿和RO-3306通過使細胞同步在G2/M期（此時同源重組最活躍）來增加HDR。類似地，CDC7抑制劑XL413延長S期持續時間，為HDR提供了更長的窗口。然而，這些策略在病毒基因組編輯中可能效果較差，因為感染在細胞群體中是異步進行的。幾種抑制NHEJ的小分子已被用于增強HDR。DNA-PKcs抑制劑如NU7026和M3814（peposertib）可將HDR效率提高約2-4倍。高效的DNA-PK抑制與大片段的缺失、染色體臂丟失和易位有關，引發了基因組不穩定的擔憂。DNA連接酶IV抑制劑SCR7可防止DNA末端連接，從而阻斷NHEJ。直接刺激同源重組的化合物也已被探索。RS-1通過穩定RAD51在單鏈DNA上的絲狀結構來增強HDR。染色質重塑提供了另一種途徑：組蛋白乙酰化使染色質松弛為常染色質狀態，增加了DNA可及性。組蛋白去乙酰化酶抑制劑，如曲古抑菌素A，在iPSC中將HDR提高了多達4倍。
篩選與選擇方法
基于熒光的篩選標記
熒光報告基因通常被整合作為標記，以富集或識別成功編輯的病毒基因組。已開發了幾種策略：
- 1.
內部核糖體進入位點：允許從單個轉錄本獨立翻譯兩個ORF，從而保留目標蛋白的氨基酸序列。但翻譯效率偏向上游ORF，下游ORF的表達通常顯著降低。
- 2.
2A自切割肽：使兩個幾乎等摩爾的蛋白質能夠通過核糖體跳躍從單個ORF產生。這種平衡的表達有利于可靠的選擇。缺點是2A序列會留下短的肽段疤痕。
- 3.
基于內含子的插入策略：報告基因在內含子內的整合提供了一種無疤痕的標記方法。GEIS系統和CRISPIE方法實現了在不改變編碼序列的情況下對目標基因表達進行可視化，或對蛋白質進行功能性標記。
- 4.
兩步選擇：當需要完全無疤痕的編輯時，可以應用兩步策略。第一步，通過HDR在靶位點附近插入一個可移除的GFP或藥物抗性盒，以便于篩選陽性克隆。第二步，精確移除該盒，只留下預期的突變而沒有任何額外的序列。
編輯病毒的克隆純化
基因組編輯后，最初的病毒群體是異質的，編輯和未編輯的基因組通常共存于同一個感染細胞中。因此，克隆純化是必不可少的。克隆純化方法包括：
- 1.
噬斑純化：在半固體覆蓋層上進行噬斑分離仍然是DNA病毒的標準方法。熒光報告基因可以通過直接選擇陽性噬斑來加速這一過程。
- 2.
細胞分選：當有熒光報告基因或其他可檢測標記時，可以使用流式細胞術預富集感染細胞。
- 3.
終點稀釋：連續稀釋確保單個孔平均接收少于一個感染單位。然后擴增顯示細胞病變效應的孔。
- 4.
液滴微流控：微流控液滴系統將單個感染細胞或病毒粒子封裝在納升級別的隔室中，實現了高通量的分離和分析。
基因組編輯的確認
獲得分離的候選克隆后，需要進行基因型和表型驗證。主要目標是：確認預期的靶向修飾是否發生；排除不需要的重排、大片段缺失或供體骨架殘留；評估編輯后的病毒是否保持預期的生長和功能特性。
- 1.
基因型分析：通常通過連接點PCR和跨越供體-基因組連接處的Sanger測序來驗證靶向編輯。對于定量評估，可以進行基于擴增子的二代測序，以分析突變譜。為了評估潛在的脫靶效應，可以對預測的頂級脫靶位點進行擴增和測序。
- 2.
表型分析：表型驗證對于確定編輯后的病毒是否保持預期的復制動力學和蛋白質功能至關重要。標準檢測包括單步和多步生長曲線、噬斑大小比較以及相對于野生型對照的病毒產量定量。
應用與代表性研究
CRISPR為基礎的基因組編輯通過實現對大型DNA基因組的精準操作，擴展了皰疹病毒研究的實驗和轉化范圍。兩項案例研究說明了這些設計原則如何成功實施。
HCMV中生長素誘導降解子介導的蛋白質控制
編輯難以轉染的人包皮成纖維細胞（HFFs）中的HCMV是一項重大技術挑戰。在這項研究中，使用IDLV將Cas9/sgRNA與供體模板一起遞送到感染細胞中。供體模板設計在兩端帶有額外的Cas9切割位點，以促進體內線性化，從而提高HDR效率。一個生長素誘導降解子（AID）標簽與一個P2A-GFP模塊一起被插入到IE1基因的下游，創建了一個兼具視覺選擇和誘導降解雙重功能的構建體。在HFF-TIR1細胞中，用吲哚-3-乙酸處理觸發了AID標記的IE1蛋白的快速降解，證實了在病毒背景下應用蛋白質靶向降解系統的可行性。
HSV-1必需基因的CRISPR編輯策略
編輯必需的病毒基因需要在整個過程中保持病毒活力的策略。本例采用了兩步敲入/敲除替換方法，在HSV-1的必需基因UL36中引入點突變。首先，使用HDR將CMV啟動子-eGFP-IRES盒插入到UL36的上游，實現eGFP和必需UL36蛋白的同時表達。這確保了即使在中間編輯階段病毒也能繁殖。然后，從這個中間體病毒中進行第二輪HDR，以移除GFP盒并引入C40S點突變（該突變廢除了UL36的N末端去泛素化酶活性）。選擇GFP陰性的噬斑并通過測序驗證。該策略提供了幾個優點：在編輯過程中保留了必需基因的表達；無需互補細胞系；與BAC重組相比縮短了時間；并且通過盒式替換實現了無疤痕編輯。
結論與展望
本綜述為將CRISPR-Cas系統應用于DNA病毒基因組編輯提供了一個實用的框架，展示了它們作為傳統BAC重組技術的替代和補充方法的潛力。重點總結了對大型DNA病毒進行基因敲除和敲入策略的關鍵設計考慮，以提高其精確性和效率。盡管存在細胞類型依賴性、遞送挑戰和潛在基因組不穩定性等實際問題，但CRISPR技術的獨特優勢在于其能夠直接編輯臨床分離株，而無需BAC克隆。這種能力極大地提高了實驗速度、可及性和適應性，為功能病毒學的新時代鋪平了道路。通過將嚴格的驗證標準與CRISPR工具的靈活性相結合，研究人員可以在保持科學嚴謹性的同時，安全地利用該技術的優勢。CRISPR系統的持續改進，加上遞送、生物信息學和合成病毒學方面的進步，最終將改變我們在基因組水平上操作和理解大型DNA病毒的方式。
