《Bioactive Materials》：ADGRG1-targeted hypoxia preconditioned extracellular vesicles ameliorate intervertebral disc degeneration by delivering taurine to disrupt the oxidative stress feedback loop-driven ferroptosis in nucleus pulposus cells
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為解決椎間盤退變（IVDD）缺乏靶向抗氧化治療的難題，研究人員設計了一種靶向膜蛋白ADGRG1的工程化低氧預處理細胞外囊泡（A1TP-HX-EVs）。該囊泡系統能夠精準遞送高含量牛磺酸至受損髓核細胞（NPCs），通過結合LKB1/MO25激活AMPK/NRF2通路，從而抑制鐵蛋白自噬（ferritinophagy）、促進線粒體修復并抵抗鐵死亡，最終實現退變椎間盤的修復。此研究為IVDD的診療一體化策略提供了新思路。
頸椎病和腰痛已成為影響人類健康和生活質量的常見頑疾，其背后最主要的“元兇”之一便是椎間盤退變。隨著全球人口老齡化加劇，這一問題帶來的社會負擔日益沉重。傳統療法往往治標不治本，因為科學家們尚未完全闡明推動椎間盤退變的核心機制。目前已知，椎間盤內部的髓核細胞（NPCs）會因衰老、炎癥、機械壓力等因素積累過多的活性氧（ROS），進而導致細胞功能失調和死亡，最終破壞椎間盤組織穩態。然而，ROS究竟如何精確地“扼殺”髓核細胞，以及如何開發出能夠精準打擊這一過程的治療方法，仍是領域內亟待攻克的難題。
本研究發表在《Bioactive Materials》上，作者團隊通過系統性的探索，揭示了驅動椎間盤退變的一個關鍵惡性循環：“ROS-線粒體功能障礙-鐵蛋白自噬”氧化應激反饋環路。他們發現，ROS的堆積不僅直接損傷細胞，還會破壞細胞的“能量工廠”——線粒體，同時激活一種被稱為“鐵蛋白自噬”的過程，導致細胞內游離鐵離子（Fe2+）暴增，從而誘發一種鐵依賴性的、獨特的程序性細胞死亡方式——鐵死亡（Ferroptosis）。這一環路像一個不斷自我放大的“死亡漩渦”，加速了髓核細胞的衰亡和椎間盤的退變。
更有趣的是，研究人員在這條死亡通路上找到了一個關鍵的“路標”——膜蛋白ADGRG1（又稱GPR56）。ADGRG1在受ROS損傷的髓核細胞表面特異性高表達，且表達水平與退變嚴重程度正相關，這使其成為精準遞送藥物的理想靶點。基于此，研究團隊開發了一種智能“納米快遞”系統：他們從低氧預處理的人胎盤間充質干細胞（pMSCs）中提取出富含抗氧化物質的細胞外囊泡（HX-EVs），并通過化學方法在其表面“安裝”了能夠特異性識別ADGRG1的短肽（A1TP），從而構建出靶向工程化囊泡（A1TP-HX-EVs）。
關鍵技術方法：
本研究綜合運用了多種關鍵技術：1）單細胞RNA測序和轉錄組學分析，用于鑒定嚴重退變髓核組織中的關鍵差異表達基因和通路；2）分子對接和微尺度熱泳動技術，驗證了ADGRG1靶向肽（A1TP）與靶點的特異性結合；3）通過點擊化學反應制備靶向分子DSPE-PEG-A1TP，并利用膜插入法構建工程化A1TP-HX-EVs；4）利用聚集誘導發光（AIE）熒光染料和高斯熒光素酶（Gluc）標記，結合活細胞工作站和生物發光成像，分別在體外和體內評估囊泡的靶向性與藥代動力學；5）使用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析囊泡內的活性小分子成分；6）通過表面等離子共振（SPR）和免疫共沉淀結合LC-MS/MS，闡明了牛磺酸與LKB1-STRAD-MO25復合物的相互作用機制；7）利用透射電鏡、線粒體壓力測試和CRISPR/Cas9基因編輯等技術，從形態、功能和基因層面驗證了治療效果與分子機制。所有動物實驗均符合相關倫理規范，臨床樣本來源于輕度退變患者手術切除的髓核組織，大鼠椎間盤退變模型通過針刺法建立。
研究結果：
3.1. ROS、髓核細胞鐵死亡和線粒體功能障礙共同加速椎間盤退變
通過對臨床患者輕度與重度退變髓核組織的單細胞測序分析，發現重度退變組織中，與鐵死亡、氧化損傷和線粒體功能障礙相關的基因顯著富集。生化與免疫熒光檢測證實，嚴重退變的髓核組織內ROS、不穩定Fe2+及脂質過氧化產物4-HNE水平升高，而關鍵鐵死亡抑制蛋白GPX4表達下調。同時，線粒體數量減少、結構（如嵴缺失）嚴重受損。結論：ROS誘導的髓核細胞鐵死亡，伴隨嚴重的線粒體結構與功能損傷，是加劇IVDD的主要原因。
3.2. ADGRG1是ROS-線粒體功能障礙-鐵蛋白自噬氧化應激反饋環路驅動髓核細胞鐵死亡的生物標志物
利用過氧化氫叔丁酯（TBHP）體外模擬ROS損傷，發現ADGRG1的表達隨損傷程度加劇而上調，且與鐵死亡標志物4-HNE共定位。在臨床樣本和大鼠IVDD模型中均證實ADGRG1表達與退變嚴重程度正相關。敲低ADGRG1并未顯著改變細胞對ROS誘導損傷的敏感性，表明ADGRG1本身不直接參與致病，而是作為氧化應激損傷和鐵死亡的膜表面生物標志物，為靶向治療提供了理想靶點。
3.3. 構建靶向ADGRG1的低氧預處理細胞外囊泡
通過分子對接和微尺度熱泳動證實了ADGRG1靶向肽（A1TP，TYFAVLM）與ADGRG1蛋白的高親和力。利用點擊化學反應合成了DSPE-PEG-A1TP，并通過膜插入法成功修飾到HX-EVs表面，形成A1TP-HX-EVs。表征結果顯示，工程化修飾未改變囊泡的典型形態、大小、電位及標志物表達，且具有良好的生物相容性。
3.4. A1TP-HX-EVs通過恢復鐵蛋白穩態和修復線粒體來緩解氧化應激反饋環路驅動的髓核細胞鐵死亡
體外實驗表明，A1TP修飾顯著增強了HX-EVs對過表達ADGRG1或TBHP損傷的髓核細胞的靶向攝取。A1TP-HX-EVs能更有效地降低細胞內ROS和Fe2+水平，抑制鐵蛋白降解和NCOA4表達，上調GPX4，從而抑制鐵死亡。同時，它能激活與線粒體呼吸鏈和生物合成相關的基因，改善線粒體最大呼吸能力，促進線粒體再生，并減少脂質過氧化。
3.5. A1TP-HX-EVs在體內恢復髓核穩態并加速椎間盤修復
在大鼠尾椎IVDD模型中，通過椎間盤內注射，AIE熒光標記和Gluc生物發光成像證實A1TP-HX-EVs能特異性靶向并富集于退變的髓核組織。治療8周后，MRI和X光顯示A1TP-HX-EVs治療組椎間盤退變Pfirrmann分級顯著降低，椎間盤高度指數（DHI）恢復最好。組織學染色（如HE、阿爾新藍、馬松三色）顯示其能最有效地促進細胞外基質（如蛋白聚糖）再生并抑制纖維化。此外，它能顯著降低髓核組織內的Fe2+、ROS和4-HNE水平，上調COL2、下調MMP13和ADGRG1表達，促進線粒體再生。
3.6. A1TP-HX-EVs通過激活AMPK/NRF2通路抑制鐵蛋白自噬并促進線粒體修復
RNA-seq和通路富集分析揭示，A1TP-HX-EVs處理能逆轉TBHP引起的基因變化，并顯著富集AMPK信號通路。Western blot證實A1TP-HX-EVs能激活AMPK及其下游SIRT1/PGC-1α，促進NRF2核轉錄。NRF2進而下調鐵蛋白自噬關鍵介質NCOA4，同時上調線粒體轉錄因子A（TFAM）。透射電鏡顯示其能有效修復線粒體嵴結構。使用AMPK抑制劑（BAY-3827）或NRF2抑制劑（ML385）可阻斷上述保護效應。
3.7. 牛磺酸是A1TP-HX-EVs中通過激活AMPK/NRF2通路促進髓核細胞修復的關鍵分子
LC-MS/MS代謝組學分析發現，與普通EVs相比，HX-EVs中多種活性小分子含量顯著差異，其中抗氧化分子牛磺酸（Taurine）含量高出約3倍。缺氧通過上調TonEBP/TAUT通路促進了pMSCs對牛磺酸的攝取和囊泡裝載。A1TP-HX-EVs能將更多牛磺酸遞送至髓核細胞。敲低TAUT導致囊泡中牛磺酸缺失（A1TP-KD-HX-EVs）后，其激活AMPK/NRF2通路、抑制鐵死亡和修復線粒體的能力幾乎喪失。相反，過表達牛磺酸合成關鍵酶CDO1以富集囊泡內牛磺酸（A1TP-OE-EVs），則能模擬A1TP-HX-EVs的治療效果。單獨使用A1TP肽或等量牛磺酸溶液效果遠遜于囊泡遞送系統，部分原因是髓核細胞本身TAUT表達極低，限制了其對游離牛磺酸的攝取。
3.8. 牛磺酸通過促進LKB1-STRAD-MO25激酶復合物形成來激活AMPK/NRF2通路
機制深究發現，牛磺酸并不影響鈣離子內流，排除了通過CaMKKβ激活AMPK的途徑。分子動力學模擬提示，硫酸根離子能穩定LKB1-STRAD-MO25激酶復合物。由于牛磺酸末端含有磺酸基團，研究人員推測其可能類似作用。免疫共沉淀聯合LC-MS/MS及表面等離子共振（SPR）實驗證實，牛磺酸能直接結合LKB1（Glu165, Arg301）和MO25（Arg194, Leu197）的特定殘基，促進LKB1-STRAD-MO25復合物的組裝，從而啟動AMPK磷酸化級聯反應。
研究結論與意義：
本研究系統揭示了椎間盤退變過程中“ROS-線粒體功能障礙-鐵蛋白自噬”氧化應激正反饋環路驅動髓核細胞鐵死亡的核心機制。創新性地將膜蛋白ADGRG1鑒定為該病理過程中的特異性生物標志物和靶點，并成功構建了ADGRG1靶向的工程化低氧預處理細胞外囊泡（A1TP-HX-EVs）。該囊泡系統實現了對受損髓核細胞的精準識別和高效遞送。研究進一步發現，HX-EVs中高富集的活性小分子牛磺酸是發揮治療作用的關鍵“貨物”，其通過結合并穩定LKB1-STRAD-MO25激酶復合物，激活AMPK/NRF2信號軸，進而抑制鐵蛋白自噬、促進線粒體修復與再生，最終打破氧化應激惡性循環，抵抗髓核細胞鐵死亡，促進退變椎間盤的修復。
該工作的意義在于：首先，從機制上深化了對椎間盤退變中細胞死亡方式的理解，明確了鐵死亡及與之耦聯的氧化應激反饋環路的關鍵角色。其次，為椎間盤退變提供了一種具有診療一體化潛力的新型靶向治療策略：ADGRG1可作為評估疾病嚴重程度的分子影像靶點，而A1TP-HX-EVs則作為集靶向、遞送和治療于一體的“智能納米藥物”。最后，闡明了牛磺酸這一常見物質通過此前未知的分子機制（促進LKB1復合物組裝）發揮強大細胞保護作用的途徑，不僅為椎間盤退變的治療提供了新的候選分子，也為理解牛磺酸在其他氧化應激相關疾病中的作用提供了新視角。
