《Microbiome》：Microbiota-derived propionate suppresses Salmonella virulence gene expression via LuxS quorum sensing
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本研究首次闡明，來自抗性雞種（藏雞）的腸道微生物代謝產物丙酸鹽，能夠通過直接靶向并抑制沙門氏菌的LuxS/AI-2群體感應（Quorum Sensing, QS）系統，顯著下調其毒力基因表達，從而為基于微生物群的感染性疾病管理策略提供了新穎的見解。
引言
特定的代謝組學特征已被廣泛認為是宿主種群對傳染病具有更強抵抗力的標志。例如，在沙門氏菌感染并按異嗜細胞與淋巴細胞比率分層的雞中，低H/L比率的雞表現出更高的抵抗力和更高的盲腸短鏈脂肪酸水平。在鼠類模型中，對沙門氏菌感染具有更強抵抗力的B6N小鼠，其腸道內iBacteroides/i豐度和丙酸鹽水平也更高。這些發現表明，宿主特異性或微生物群調控的代謝物在調節感染易感性和維持腸道穩態中起著核心作用。因此，闡明宿主特異性代謝景觀與疾病抵抗性之間的機制聯系，是基于代謝物治療和預防策略發展的關鍵前沿。
沙門氏菌是一種全球流行的病原體。群體感應是沙門氏菌中的一個關鍵調控機制，協調著對其致病性至關重要的群體行為，如生物膜形成、運動性和宿主細胞侵襲。其中，iluxS/i基因編碼S-核糖基高半胱氨酸裂解酶，是合成自誘導物-2所必需的酶，而AI-2是參與種間通訊的保守信號分子，是調節沙門氏菌毒力相關表型的關鍵調節因子。
結果
1. 藏雞中S. Enteritidis毒力降低與獨特的腸道菌群組成和關鍵毒力相關基因表達改變有關
先前研究表明，宿主遺傳背景影響對沙門氏菌感染的易感性。本研究發現，與商業肉雞相比，藏雞在感染S. Enteritidis后，其盲腸組織和糞便中關鍵的沙門氏菌毒力基因（包括群體感應基因iluxS/i、鞭毛蛋白編碼基因ifliC/i和生物膜形成核心調節因子icsgD/i）的表達水平顯著降低。這些發現表明不同雞種間存在沙門氏菌毒力基因表達的差異，藏雞與毒力基因表達受到抑制相關。
鑒于腸道菌群在調節沙門氏菌定植和毒力中的重要作用，我們假設藏雞的微生物群可能促進了這種表型。為此，我們將成年藏雞的糞便菌群移植給肉雞，隨后進行S. Enteritidis感染。結果表明，與PBS處理的對照組相比，FMT顯著降低了受體肉雞盲腸內容物中ifliC/i和iluxS/i的表達。這一結果支持了藏雞來源的腸道菌群可以減弱易感宿主中S. Enteritidis毒力基因表達的觀點。
2. FMT重塑了S. Enteritidis感染宿主的盲腸菌群組成
為了研究FMT對感染S. Enteritidis宿主盲腸菌群組成的影響，我們分析了盲腸微生物組。結果表明，FMT顯著增加了豐度加權的Alpha多樣性（如更高的Shannon和Simpson指數），并重塑了盲腸菌群結構，使其群落結構更均勻。屬水平分析表明，FMT降低了潛在有害細菌如iMegamonas/i的相對豐度，同時增加了有益細菌如iBacteroides/i的相對豐度。LEfSe分析和Wilcoxon秩和檢驗進一步鑒定出在FMT組中顯著富集的菌屬，包括iBacteroides/i、iDesulfovibrio/i、iPhascolarctobacterium/i和iFaecalibacterium/i等，這些菌屬已知能通過發酵復雜多糖產生短鏈脂肪酸。
3. 藏雞來源的丙酸鹽是抑制S. Enteritidis毒力基因表達的關鍵代謝物
為了鑒定導致藏雞中S. Enteritidis毒力基因表達降低的因素，我們研究了腸道來源的微生物代謝物的作用。將藏雞和肉雞的糞便細菌懸浮液與S. Enteritidis共培養，結果顯示藏雞來源的糞便細菌能顯著抑制S. Enteritidis的生物膜形成。通過熱滅活處理和Transwell系統分離微生物與代謝物后，我們發現可溶性微生物代謝物是介導S. Enteritidis毒力基因表達降低的介質。
我們關注到FMT后增加的菌屬（如iBacteroides/i、iFaecalibacterium/i等）是產生SCFA的細菌。通過液相色譜-質譜聯用技術定量分析SCFA，我們發現，在未感染和感染的藏雞中，其盲腸內容物的丙酸鹽濃度均顯著高于肉雞。此外，FMT處理的感染肉雞血清中丁酸、乙酸和丙酸鹽水平均有所增加。相關性分析進一步顯示，丙酸鹽濃度和特定微生物類群與三個關鍵毒力基因的表達呈負相關，而丙酸鹽濃度與這些微生物的豐度呈正相關。這些結果支持了丙酸鹽這一在藏雞中富集的微生物代謝物，在減弱S. Enteritidis毒力基因表達中起關鍵作用的假設。
4. 丙酸鹽通過抑制群體感應和生物膜形成來減弱S. Enteritidis毒力基因表達
為了直接評估丙酸鹽對S. Enteritidis毒力基因表達的影響，我們進行了體外共培養實驗。生長曲線分析顯示，在400 mM時丙酸鹽完全抑制了S. Enteritidis的增殖。生物膜形成實驗顯示，丙酸鹽在50-200 mM濃度范圍內呈劑量依賴性降低生物膜生物量。
鑒于由LuxS合成的AI-2在細菌毒力、群體感應和生物膜調節中起關鍵作用，我們接下來檢測了丙酸鹽存在下的AI-2活性。用100和200 mM丙酸鹽處理S. Enteritidis導致AI-2信號活性顯著降低。相應地，轉錄分析顯示，50、100和200 mM濃度的丙酸鹽顯著下調了ifliC/i、icsgD/i和iluxS/i的表達。
為了評估丙酸鹽在體內是否產生類似效應，我們使用了肉雞感染模型。通過飲用水給肉雞連續六天施用50 mM丙酸鹽，隨后進行S. Enteritidis攻擊。該處理顯著降低了感染后盲腸食糜中icsgD/i和iluxS/i的表達。
我們進一步使用Caco-2人上皮細胞感染模型探索丙酸鹽的影響。丙酸鹽沒有改變S. Enteritidis對Caco-2細胞的粘附，但顯著降低了細菌的侵襲。相應地，從丙酸鹽處理過的感染細胞中分離的細菌，其ifliC/i、icsgD/i和iluxS/i的表達也顯著受到抑制。這些發現共同表明，丙酸鹽在體外和體內均能抑制S. Enteritidis的毒力基因表達，其機制是通過下調iluxS/i介導的AI-2信號傳導和損害生物膜形成。
5. LuxS/AI-2通路介導丙酸鹽誘導的S. Enteritidis毒力基因表達減弱
為了進一步闡明丙酸鹽抑制S. Enteritidis毒力基因表達的分子機制，我們通過λ-red同源重組技術構建了iluxS/i基因敲除突變株，并構建了攜帶質粒表達iluxS/i的互補菌株。所有菌株，包括野生型、iluxS/i缺失突變株和互補株，均表現出可比的生長動力學，表明iluxS/i缺失不影響細菌的整體生存能力。
功能分析顯示，iluxS/i缺失顯著降低了S. Enteritidis的生物膜形成和AI-2活性，而這些在iluxS/i互補后得到恢復。值得注意的是，丙酸鹽對野生型菌株生物膜形成和AI-2活性的抑制作用在iluxS/i缺失突變株中被消除。互補后，丙酸鹽恢復了其抑制作用，證實iluxS/i的存在對于丙酸鹽介導的毒力基因表達調節是必需的。基因表達分析進一步支持了這一觀察。
體內實驗使用肉雞模型證實了體外發現。感染iluxS/i缺失菌株的雞，丙酸鹽對icsgD/i的抑制被消除。在Caco-2上皮細胞感染模型中，當用丙酸鹽預處理細胞并隨后感染iluxS/i缺失或互補菌株時，在突變背景下細菌侵襲力和ifliC/i表達均未觀察到顯著變化。然而，icsgD/i的表達在iluxS/i缺失菌株中經丙酸鹽處理后反而增加，而在互補菌株中被顯著抑制，這表明icsgD/i可能同時受到LuxS依賴和非依賴機制的調控。
綜上，這些結果證明LuxS/AI-2群體感應通路是丙酸鹽抑制S. Enteritidis毒力基因表達的關鍵介質。具體來說，丙酸鹽似乎作用于iluxS/i的上游，抑制其表達和下游信號傳導，從而降低運動性、侵襲力和生物膜形成。
6. 丙酸直接結合LuxS蛋白的異亮氨酸53位點以抑制S. Enteritidis毒力基因表達
為了研究丙酸鹽與LuxS相互作用的分子基礎，我們采用分子對接分析來預測丙酸與LuxS蛋白之間的結合界面。結果顯示，兩者存在強且特異性的相互作用，其結合自由能為-3.9 kcal/mol。預測的關鍵結合殘基包括LuxS核心結構域內的Glu50、Ile53、Pro80、Gly82和Arg84。
為了驗證對接預測，我們通過丙氨酸置換在每個預測的結合殘基上構建了定點LuxS突變體。生長曲線分析顯示野生型與各突變株之間無顯著差異。接下來，我們將每種突變株與50 mM丙酸鹽共培養，并評估生物膜形成和AI-2活性。所有LuxS突變體在丙酸鹽作用下均顯示出生物膜形成減少。然而，在LuxSI53A和LuxSG82A突變體中，AI-2信號活性未被丙酸鹽抑制，表明這些位點的突變破壞了丙酸鹽介導的群體感應抑制。轉錄譜分析顯示，盡管ifliC/i的表達在所有突變體中都受到丙酸鹽的一致抑制，但icsgD/i表達的下調在LuxSI53A、LuxSG82A和LuxSR84A菌株中被消除。
在Caco-2細胞感染模型中進一步驗證了這些突變的功能影響。盡管所有突變體的上皮細胞粘附性保持不變，但LuxSI53A和LuxSG82A突變體的侵襲力均有所降低。值得注意的是，只有LuxSI53A菌株在丙酸鹽處理后，其ifliC/i和icsgD/i的表達保持不變，從而將Ile53確定為丙酸鹽介導LuxS抑制的關鍵殘基。
這些發現共同提供了丙酸鹽通過直接結合LuxS來降低S. Enteritidis毒力基因表達的機制證據，其中第53位的異亮氨酸是調節群體感應和下游毒力基因表達的關鍵相互作用位點。
討論
本土家禽品種，如藏雞，因其強大的疾病抵抗力而日益受到認可。本研究利用S. Enteritidis感染模型，揭示了藏雞與商業肉雞之間觀察到的抵抗力差異背后的分子和微生物決定因素。我們的發現不僅證實了先前關于藏雞抵抗力增強的報告，還闡明了一種特定的微生物群衍生代謝物——丙酸鹽，通過LuxS/AI-2群體感應系統在調節病原體毒力基因表達中發揮核心作用。
感染S. Enteritidis后，藏雞表現出S. Enteritidis毒力基因表達降低。這種表型可通過FMT轉移，表明存在微生物群介導的抗性機制。與這些解釋一致的是，FMT顯著改變了感染肉雞盲腸菌群的多樣性和組成。值得注意的是，FMT富集了多個通常與短鏈脂肪酸代謝相關的菌屬，包括iBacteroides/i、iFaecalibacterium/i、iPhascolarctobacterium/i和iRikenellaceae/iRC9gut_group，表明其SCFA生產能力增強，尤其是丙酸鹽。在藏雞微生物群的代謝產物中，SCFAs作為關鍵調節因子出現，其中丙酸鹽在體外和體內顯示出抑制毒力基因表達的顯著能力。
從機制上講，我們的數據顯示丙酸鹽通過抑制LuxS/AI-2群體感應系統來抑制毒力基因表達，這是一個調節生物膜形成、運動性和分泌系統等關鍵致病性狀的保守種間通訊通路。具體而言，丙酸鹽下調了iluxS/i轉錄，降低了AI-2活性，并抑制了包括ifliC/i和icsgD/i在內的毒力相關基因的表達。這些效應在iluxS/i缺陷菌株中被消除，從而確定了LuxS是丙酸鹽作用的主要靶點。
為了剖析這種相互作用的分子基礎，我們采用了分子對接，預測丙酸以-3.9 kcal/mol的結合能穩定地結合到LuxS蛋白上。結合位點分析強調了Ile53、Pro80和Arg84為潛在的相互作用殘基，定點誘變證實Ile53對于丙酸鹽的抑制效應是必需的。Ile53的突變消除了丙酸鹽抑制AI-2產生和生物膜基因表達的能力，強調了這種相互作用的特異性。
盡管我們在本研究中鑒定了豐度與丙酸鹽濃度呈正相關的微生物，但該背景下丙酸鹽生產的具體微生物貢獻者仍未確定。目前的研究集中于丙酸鹽在減弱S. Enteritidis毒力中的功能作用；然而，未來的工作將致力于系統性地鑒定和表征藏雞腸道生態系統內產生丙酸鹽的微生物類群，并探索它們的生態互作。闡明這些微生物貢獻者將加深我們對宿主-微生物群-代謝物相互作用的理解，并可能有助于有針對性地調控腸道群落以增強疾病抵抗力。
結論
總之，我們的研究將丙酸鹽定位為一種通過干擾群體感應來有效調節細菌毒力基因表達的天然衍生調節劑。通過鑒定特定的微生物代謝物及其分子靶點，我們在宿主-微生物群相互作用與病原體控制之間架起了橋梁，為抗菌策略提供了新的途徑。這些見解也強調了本土品種作為有益微生物功能和代謝物儲存庫的未被充分利用的潛力。在抗菌素耐藥性日益嚴峻的時代，這種宿主-微生物群-病原體相互作用為開發基于微生物群、針對腸道感染的代謝物干預措施提供了廣闊前景。
