隨著全球對海產品需求的增長，可持續水產養殖需要在增強魚類健康和飼料效率的同時，減少對環境的影響。本研究評估了新菌株褶皺芽孢桿菌NM007在養殖尼羅羅非魚中的潛在益生作用。研究人員設置了三個不同劑量的NM007添加組（T₁， 0.1 g/kg；T₂， 0.2 g/kg；T₃， 0.3 g/kg）和一個不添加益生菌的基礎商業飼料對照組。實驗使用了240尾平均初始體重為5.13 ± 0.09克的魚，在12個玻璃水族箱中進行了為期90天的飼養。結果表明，與對照組相比，所有處理組在生長、飼料利用和生理健康方面均表現出顯著改善。其中，T₂組（0.2 g/kg）表現出最高的生長性能，每條魚的增重達到45.66 ± 1.41克，并且擁有更優的血液學指標，包括血紅蛋白、紅細胞和白細胞。所有處理組的肝功能均得到改善，T₂組記錄的丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶水平最低，而T₃組的總蛋白和白蛋白水平最高。抗氧化活性顯著增強，所有益生菌處理組的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶水平升高，丙二醛水平降低。溶菌酶活性在T₂組達到峰值，表明免疫活性增強。血清和腸道中的消化酶活性在所有處理組中均顯著高于對照組。組織學分析顯示，腸道絨毛結構、肌層厚度和淋巴細胞計數得到改善，且肝臟無炎癥或毒性跡象。總體而言，新的褶皺芽孢桿菌NM007通過增強尼羅羅非魚的生長、抗氧化防御、免疫反應、消化酶活性和組織健康，顯示出強大的益生潛力，表明其有望成為水產養殖中一種安全有效的新型益生菌。

過去七年，埃及水產養殖業經歷了快速擴張，目前是非洲的領導者，在全球羅非魚產量中排名第三，在全球水產養殖總產量中排名第六。尼羅羅非魚是埃及最主要的養殖魚類，占全國水產養殖產量的約65%。然而，該行業在發展過程中面臨疾病頻發、環境問題以及野生魚類資源不斷減少等諸多挑戰。為解決這些問題，使用益生菌是一種被廣泛討論的生態方法。

益生菌被定義為可為宿主及其環境提供健康益處的活性微生物。在魚類中，它們可以通過改變微生物群、增強抗病性、改善健康參數、優化生長速率和飼料轉化效率來改善宿主健康狀況。大量研究證明，在飼料中添加益生菌可改善尼羅羅非魚的生長和免疫反應。益生菌的使用在過去二十年中變得越來越重要，作為抗生素使用的替代方案。在水產養殖中，關于益生菌的理解和應用已得到廣泛研究，其中乳桿菌屬和芽孢桿菌屬的益生菌已被證明在水產養殖中極為有效。它們有助于提高魚蝦的產量和存活率，改善腸道健康和免疫系統，并減少疾病的發生。

在埃及，水產養殖作為主要產業，面臨著水質問題、疾病爆發和抗生素過度使用等重大挑戰。益生菌可以通過改善水質、增強魚類免疫系統和減少對抗生素的需求，在應對這些挑戰中發揮關鍵作用。因此，盡管存在有效的益生菌，持續研究以發現新的益生菌候選菌株用于水產養殖仍然至關重要。水生生物的極端多樣性，以及其生理和生態位的差異，進一步強調了需要不同的益生菌。新的益生菌可能更具針對性，能夠解決不同水產養殖系統中出現的具體問題，例如溫度波動、鹽度變化和新病原體的出現。

褶皺芽孢桿菌于2020年首次被發現，關于該菌株的信息有限。根據先前的研究，褶皺芽孢桿菌NM007顯示出作為益生菌菌株的潛力，因為它能夠產生消化酶并具有其他有益于水產養殖的特性。此外，海產品需求的不斷增長，導致了新疾病的出現和更多抗生素的使用，也給行業帶來了變革壓力。發現具有特定應用的新益生菌菌株有助于提高魚類的抗應激能力、飼料轉化率和疾病防御機制。因此，用新型益生菌進行試驗對于提高水產養殖的穩定性、實現長期的可持續增長和高產至關重要。

物種特異性反應在決定益生菌在水產養殖中的有效性方面起著至關重要的作用，因為宿主魚類和益生菌菌株之間的相互作用在不同物種之間可能存在很大差異。因此，迫切需要分離、鑒定和評估尚未在魚類中測試過的新型益生菌候選菌，以增強水產養殖的可持續性和健康管理。先前的研究主要集中于常見的菌種，如枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌。探索未經測試的新替代品可能會打開通往性能更優菌株的大門，從而幫助該行業更具可持續性。因此，本研究旨在評估褶皺芽孢桿菌NM007菌株作為益生菌對尼羅羅非魚生長性能、血液生化指標、腸道形態、免疫反應、消化酶和抗氧化活性的影響。

本研究獲得了埃及Kafrelsheikh大學水生動物護理與研究倫理委員會的批準，并遵循埃及關于魚類使用和處理的倫理法規。尼羅羅非魚幼魚購自埃及Kafrelsheikh省的一個私人孵化場。實驗前，魚在實驗室條件下適應兩周。整個研究期間保持12小時光照和12小時黑暗的光周期。實驗共使用了240尾平均初始體重為5.13 ± 0.09克的魚，隨機分配到12個相同大小的玻璃水族箱，每個水族箱20尾魚，進行為期90天的實驗。魚類被飼喂商業飼料和一種潛在益生菌——褶皺芽孢桿菌NM007。該菌株先前在本實驗室分離和制備，以1 × 10¹⁰CFU/g的濃度，用葵花籽油噴灑混合到基礎飼料中，濃度分別為0克、0.1克、0.2克和0.3克每公斤飼料，對應標記為對照組、T₁、T₂和T₃組。飼料每天投喂兩次，投喂量為總生物量的4%。每日記錄死亡率。在整個實驗期間，水質參數保持在尼羅羅非魚的正常平均值附近。

實驗結束后，收集魚并進行測量。生長性能指標包括體重增加、特定生長率、飼料攝入量、飼料轉化率、蛋白質效率比、肥滿度、肝體指數、內臟體指數和存活率。對肝臟和腸道進行組織學處理，通過蘇木精-伊紅染色，并在光學顯微鏡下觀察和拍照。定量分析包括測量絨毛高度、絨毛寬度、肌層厚度、淋巴細胞和杯狀細胞計數。從尾靜脈采集血液樣本，用于血液學和血清生化分析。血液學分析包括紅細胞計數、血紅蛋白濃度、總白細胞計數和白細胞分類計數。血清生化分析包括天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、總蛋白、白蛋白、球蛋白、堿性磷酸酶、膽紅素、膽固醇、尿素、肌酐和葡萄糖的測定。使用酶聯免疫吸附測定試劑盒測定血清中的抗氧化指標，包括過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛和超氧化物歧化酶。使用診斷試劑盒測定血清中的淀粉酶和脂肪酶活性。腸道消化酶活性通過測定蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性來評估。通過酶聯免疫吸附測定法測定血清溶菌酶活性以評估免疫反應。實驗結束時，從每組選取五尾魚進行全魚體成分分析，測定粗蛋白、粗脂肪、碳水化合物、水分和灰分含量。使用GraphPad Prism和SPSS軟件進行統計分析，通過單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗比較不同處理組間的差異。

飼料中添加褶皺芽孢桿菌NM007顯著改善了尼羅羅非魚的多個生長參數。T₂組獲得了最高的增重、特定生長率、蛋白質效率比和內臟體指數。同一組的飼料轉化率也最高，肥滿度在T₂組也最高。所有實驗組的存活率均為100%，整個研究期間未觀察到死亡。

腸道和肝臟的組織形態學變化顯示，與對照組相比，所有益生菌處理組的腸道組織架構均有改善。定量組織形態學分析顯示，T₃組的肌層厚度顯著增加。粘膜層測量顯示，T₂組的魚具有最大的絨毛高度和寬度，而絨毛厚度無顯著差異。此外，T₂組記錄的淋巴細胞計數和杯狀細胞數量最高，表明腸道免疫活性增強。各組之間粘膜下層厚度無顯著差異。總體而言，特別是在飼料中添加0.2 g/kg NM007的T₂組，尼羅羅非魚的腸道組織結構和粘膜免疫力得到顯著改善。肝臟組織學檢查顯示，所有處理組的肝臟結構正常，沒有益生菌誘導毒性的跡象。

血液學分析顯示，除異嗜細胞百分比外，所有測量參數在處理組間均存在顯著差異。T₂組的魚表現出最高的血紅蛋白濃度、紅細胞計數和白細胞計數，表明氧運輸和免疫反應增強。T₁組顯示出最高的淋巴細胞百分比，表明細胞免疫受到刺激。總體而言，飼料中添加褶皺芽孢桿菌NM007，特別是在T₂組，對尼羅羅非魚的血液學參數產生了積極影響，反映了生理和免疫狀態的改善。

生化分析結果顯示，除球蛋白、尿素和肌酐外，所有參數在處理組間均存在顯著差異。T₃組的魚表現出最高的總蛋白和白蛋白水平，表明蛋白質合成和肝功能改善。相反，最低的丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶活性記錄在T₂組，表明肝臟應激減輕，肝臟完整性更好。T₁組的膽固醇水平最高。堿性磷酸酶和膽紅素水平在T₃組最高。葡萄糖水平在T₂組顯著下降，反映了代謝效率的提高。這些結果表明，補充褶皺芽孢桿菌NM007，特別是在T₂和T₃組，改善了尼羅羅非魚的肝功能和代謝健康，同時降低了肝臟應激的生化指標。

與對照組相比，所有益生菌處理組的抗氧化酶活性均顯著增加。超氧化物歧化酶活性在T₃組最高，過氧化氫酶活性在T₃組最高，谷胱甘肽過氧化物酶活性在T₂組最高。相反，作為脂質過氧化指標的丙二醛水平在對照組最高，在處理組中顯著下降，在T₃組達到最低值。這些結果表明，飼料中添加褶皺芽孢桿菌NM007增強了尼羅羅非魚的抗氧化防御能力，同時減少了氧化應激。

血清消化酶活性顯示，與對照組相比，所有益生菌處理組的淀粉酶活性均顯著更高，T₃組值最高。同樣，處理組的脂肪酶活性也顯著增加，T₁組的活性最高。腸道消化酶的相對活性顯示，與對照組相比，所有益生菌處理組的蛋白酶活性均更高，T₃組值最高。淀粉酶活性在處理組中也有所升高，T₃組達到最高水平。同樣，益生菌添加組的脂肪酶活性增加，T₃組記錄的值最高。

作為先天免疫反應指標的溶菌酶活性顯示，與對照組相比，所有益生菌添加組的溶菌酶活性均顯著更高，T₂組的水平最高。

全魚體的蛋白質、脂肪、灰分、碳水化合物、水分和干物質百分比在所有實驗組和對照組之間均存在顯著差異。最高的蛋白質百分比在T₂組報告，最高的脂肪百分比在T₃組報告。

本研究的結果表明，在飼料中添加芽孢桿菌屬益生菌可顯著提高生長速度和飼料利用效率，這表明芽孢桿菌屬益生菌可以減輕應激并促進魚類健康。這在尼羅羅非魚以及其他淡水魚和海水魚中都有記錄。許多研究表明，芽孢桿菌屬可以在魚類腸道中定殖，產生消化酶，并解毒有害的飼料成分，從而共同維持腸道健康，提高營養物質的吸收、利用和消化率。最近的研究還強調，芽孢桿菌益生菌可以調節腸道微生物群的組成，從而改善腸道屏障功能和排除病原體，這與我們觀察到的腸道組織形態學改善相一致。

此外，改善采食量、飼料效率和生長速度正成為水產養殖實踐的趨勢。在淡水和海水魚類中，使用單菌株或多菌株形式的益生菌對改善血液參數、免疫反應、飼料利用和生長性能具有許多有益作用。本研究發現，在飼料中添加褶皺芽孢桿菌NM007益生菌，增強了尼羅羅非魚的生長參數、飼料轉化率、蛋白質效率和腸道重量。最顯著的差異記錄在T₂組。類似的研究也觀察到芽孢桿菌菌株在90天后改善了飼料轉化率和增重，支持了我們的發現。生長增強可能直接與處理組中觀察到的腸道消化酶活性增加有關，這表明了除單純觀察體重增加之外的功能機制。值得注意的是，雖然采食量和肝體指數沒有顯著變化，但觀察到的生長和飼料轉化率的改善表明，益生菌提高了營養利用效率，而不是簡單地增加食欲，突顯了其在優化飼料轉化方面的作用。

在本研究中，飼喂添加了褶皺芽孢桿菌NM007飼料的羅非魚，其腸道吸收表面形態得到了改善。具體而言，吸收表面積表現為T₂組魚的腸道絨毛高度、寬度和厚度的增加。這些觀察結果可能是由于益生菌直接影響腸道微生物群，進而促進魚類腸道中碳水化合物的產生，從而生成短鏈脂肪酸，如丙酸、丁酸和乙酸，在較高濃度下對上皮增殖具有刺激作用。

血液參數分析顯示，飼喂添加芽孢桿菌益生菌飼料的魚，其血液學指標得到改善，包括血紅蛋白、紅細胞和白細胞計數。此外，大量研究表明，飼喂基于芽孢桿菌益生菌的尼羅羅非魚，其血液學參數有所增加。在這項研究中，飼喂添加了褶皺芽孢桿菌NM007飼料的組與對照組之間存在顯著差異，特別是T₂組，其血紅蛋白水平的改善最為顯著。這表明向組織和細胞的氧氣輸送更好，從而增加了細胞的有氧能力和能量利用。高血紅蛋白濃度還可以提高持續活動的能力，這對處于應激或活躍環境中的生物體是有益的。T₂處理組的紅細胞計數也最高，反映了紅細胞生成的增加。紅細胞增加有助于向全身組織輸送氧氣，促進新陳代謝以及組織和器官的發育。此外，在T₂組觀察到的白細胞計數最高，反映了良好的免疫力。白細胞計數增加是有利的指標，因為它代表了免疫系統的更好反應和對疾病的總體抵抗力。此外，結果表明，褶皺芽孢桿菌NM007在增加血紅蛋白、紅細胞、白細胞和其他血液學參數方面發揮了作用。這表明褶皺芽孢桿菌NM007可能有效增強攜氧能力和整體血液健康，從而潛在地改善魚類的健康狀況。

T₁處理組的淋巴細胞百分比最高，對應于強大的適應性免疫。淋巴細胞是機體免疫系統的核心，它們參與抗體的產生和免疫反應的調控。淋巴細胞百分比的增加意味著具有更好的抵抗感染以及增強免疫細胞監視的能力。