葡萄是全球具有重要社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水果作物，但栽培廣泛的歐洲葡萄（Vitis vinifera L.）極易感染由真菌病原菌Erysiphe necator引起的白粉病。相比之下，許多中國(guó)野生葡萄物種，如Vitis quinquangularis，表現(xiàn)出對(duì)該病原菌的強(qiáng)抗性。這種天然變異為挖掘關(guān)鍵抗病基因提供了寶貴的遺傳資源。本研究旨在從野生中國(guó)葡萄V. quinquangularis克隆‘Shang-24’中鑒定并表征抗白粉病基因，以增強(qiáng)栽培葡萄的免疫力。

植物通過(guò)受體識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMP），從而激活模式觸發(fā)免疫（PTI）。受體樣激酶（RLK）家族在其中扮演核心角色。凝集素受體樣激酶（LecRK）是RLK的一個(gè)亞家族，其中G型LecRK以其胞外B-凝集素結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣鳎�在識(shí)別多種病原體和植物免疫應(yīng)答中具有重要作用。研究表明，G型LecRK通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧（ROS）積累、程序性細(xì)胞死亡（PCD）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在免疫信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮保守功能。然而，G型LecRK在葡萄抗病中的精確功能和下游信號(hào)機(jī)制仍知之甚少。同時(shí)，免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活可能對(duì)植物生長(zhǎng)有害，因此植物進(jìn)化出了復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制來(lái)平衡免疫與生長(zhǎng)。LecRK在通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間來(lái)平衡植物免疫與生長(zhǎng)方面起著關(guān)鍵作用，但葡萄中LecRK如何精細(xì)調(diào)控免疫激活與抑制的分子機(jī)制在很大程度上仍是未知的。

從抗病的野生中國(guó)葡萄V. quinquangularis ‘Shang-24’的轉(zhuǎn)錄組分析中，鑒定出34個(gè)與抗病相關(guān)的G型LecRK基因。表達(dá)分析顯示，在E. necator接種后，VqLecRKV.4的轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)最高。蛋白序列分析預(yù)測(cè)VqLecRKV.4具有跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)其定位于細(xì)胞膜上。

為了進(jìn)一步研究VqLecRKV.4的功能，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，在易感葡萄品種‘Thompson Seedless’中產(chǎn)生了VqLecRKV.4過(guò)表達(dá)（OE-VqLecRKV.4）和RNA干擾（RNAi-VqLecRKV.4）株系。接種白粉病菌11天后，過(guò)表達(dá)株系表現(xiàn)出顯著減輕的病害癥狀，病斑和孢子濃度更少，而RNAi株系則顯示更多的病斑和更高的孢子濃度。此外，過(guò)表達(dá)株系在侵染部位出現(xiàn)葉片黃化和明顯的細(xì)胞死亡，這在野生型（WT）或RNAi株系中未觀察到。在接種后1天，與WT相比，過(guò)表達(dá)葉片中每個(gè)菌落的菌絲長(zhǎng)度更短，而RNAi葉片中則更長(zhǎng)。這些觀察結(jié)果表明發(fā)生了過(guò)敏反應(yīng)（HR），這是一種在植物與生物營(yíng)養(yǎng)型病原體互作中阻止病原體進(jìn)一步獲取營(yíng)養(yǎng)的防御機(jī)制。此外，OE-VqLecRKV.4株系在接種后積累了更高水平的H₂O₂，而WT和RNAi株系僅顯示最小積累。與之相一致，與WT相比，OE-VqLecRKV.4株系中的超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著升高，而RNAi株系中則降低。RT-qPCR分析顯示，在VqLecRKV.4過(guò)表達(dá)株系中，VvrbohC2、VvEDS1和VvPR5的轉(zhuǎn)錄水平均高于野生型和干擾株系。這些結(jié)果共同表明，VqLecRKV.4是葡萄抗白粉病的關(guān)鍵正向調(diào)節(jié)因子，可能通過(guò)調(diào)節(jié)ROS介導(dǎo)的防御機(jī)制有效限制病原體生長(zhǎng)。

為了探究VqLecRKV.4增強(qiáng)白粉病抗性的機(jī)制，通過(guò)TurboID介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記技術(shù)來(lái)鑒定VqLecRKV.4鄰近的蛋白質(zhì)。質(zhì)譜分析在VqLecRKV.4過(guò)表達(dá)組中鑒定出343個(gè)蛋白質(zhì)。基因本體（GO）功能分類和統(tǒng)計(jì)分析顯示，氧化還原酶的一個(gè)子集顯著富集。基于GO和KEGG通路分析，選擇了六個(gè)候選蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究。隨后的DUAL膜系統(tǒng)篩選證明了VqLecRKV.4與VqCu/ZnSOD1在酵母細(xì)胞中的相互作用。

通過(guò)BiFC、split-LUC和CoIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了VqLecRKV.4與VqCu/ZnSOD1在植物體內(nèi)的相互作用。蛋白質(zhì)功能與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，VqCu/ZnSOD1定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。然而，當(dāng)與VqLecRKV.4共表達(dá)時(shí)，兩種蛋白質(zhì)都專一定位于細(xì)胞質(zhì)中，這表明VqLecRKV.4可能通過(guò)細(xì)胞相互作用影響VqCu/ZnSOD1蛋白的定位。

超氧化物歧化酶（SOD）在植物病害防御中起著關(guān)鍵作用，并已被證明能增強(qiáng)大麥和水稻對(duì)白粉病的抗性。VqCu/ZnSOD1編碼152個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白大小為15 kDa，屬于超氧化物歧化酶[Cu-Zn]家族。為了研究VqCu/ZnSOD1如何調(diào)控葡萄對(duì)白粉病的抗性，在‘Thompson Seedless’葉片中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)和RNA干擾VqCu/ZnSOD1，并在接種后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量基因表達(dá)。在接種后7天，與空載體（OE和RNAi）和RNAi葉片相比，VqCu/ZnSOD1過(guò)表達(dá)葉片顯示出更少的真菌菌絲。此外，在接種后3天，OE-VqCu/ZnSOD1葉片中的H₂O₂積累更明顯，而RNAi-VqCu/ZnSOD1葉片僅顯示最小積累。這些發(fā)現(xiàn)表明VqCu/ZnSOD1正向調(diào)節(jié)H₂O₂水平，從而增強(qiáng)葡萄對(duì)白粉病的防御。

為了進(jìn)一步了解VqLecRKV.4如何影響VqCu/ZnSOD1表達(dá)，我們檢測(cè)了在VqLecRKV.4 OE和RNAi株系中接種E. necator后不同時(shí)間點(diǎn)VqCu/ZnSOD1的表達(dá)。從接種后0到3天，過(guò)表達(dá)株系中的表達(dá)持續(xù)增加并顯著高于野生型，而RNAi株系中的表達(dá)顯著較低。這些結(jié)果表明，在響應(yīng)E. necator感染時(shí)，VqLecRKV.4增強(qiáng)了葡萄中VqCu/ZnSOD1的表達(dá)，從而有助于其抗白粉病。

RLK識(shí)別真菌中的PAMP，并通過(guò)磷酸化下游底物傳遞信號(hào)。在本研究中，采用DIA策略的質(zhì)譜分析來(lái)研究VqLecRKV.4過(guò)表達(dá)葡萄株系中的磷酸化蛋白質(zhì)。在接種E. necator后6小時(shí)，檢測(cè)到10221個(gè)肽段（對(duì)應(yīng)6467個(gè)蛋白質(zhì)）發(fā)生磷酸化，其中9308個(gè)肽段的磷酸化可能性超過(guò)90%。磷酸化位點(diǎn)分析顯示，絲氨酸（83.43%）是最常被磷酸化的氨基酸。在2455個(gè)表達(dá)發(fā)生變化的磷酸化蛋白質(zhì)中，1247個(gè)上調(diào)，1208個(gè)下調(diào)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明這些蛋白質(zhì)主要位于細(xì)胞核、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。根據(jù)差異表達(dá)水平將蛋白質(zhì)分為四組，并特別關(guān)注Q4組（>2.0）。

ROS在植物抗病性中起著至關(guān)重要的作用。對(duì)Q4組差異表達(dá)的翻譯后修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行GO和KEGG分析，揭示了與氧化還原酶活性相關(guān)的分子功能顯著富集，氧化磷酸化通路也顯著富集。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析鑒定出某些過(guò)氧化物酶的富集，表明VqLecRKV.4介導(dǎo)的葡萄白粉病抗性涉及氧化還原酶活性。其中，14個(gè)氧化還原酶與ROS通路相關(guān)，包括先前鑒定出的蛋白質(zhì)VqCu/ZnSOD1，其磷酸化水平增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，在接種E. necator后，葡萄通過(guò)激活VqLecRKV.4，通過(guò)磷酸化介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS信號(hào)傳導(dǎo)。

植物面臨生物和非生物脅迫，它們?nèi)绾纹胶夥烙�反�?yīng)與正常生長(zhǎng)以避免過(guò)度反應(yīng)仍在研究中。過(guò)表達(dá)VqLecRKV.4會(huì)引發(fā)ROS爆發(fā)并誘導(dǎo)HR。然而，細(xì)胞死亡并未廣泛分布在病原體感染部位鄰近區(qū)域，也未觀察到葉片組織的壞死，這表明葡萄具有及時(shí)清除過(guò)量H₂O₂積累的機(jī)制。先前的轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出另一個(gè)受體樣激酶VqBAK1，已被證明可調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡。在本研究中，使用Y2H實(shí)驗(yàn)證明了VqLecRKV.4與VqBAK1之間的相互作用，并通過(guò)BiFC和CoIP實(shí)驗(yàn)在植物組織中進(jìn)一步證實(shí)。

為了驗(yàn)證VqBAK1在葡萄中的功能，產(chǎn)生了RNA干擾（RNAi-VqBAK1）株系。將VqLecRKV.4瞬時(shí)表達(dá)在RNAi-VqBAK1和WT株系中，結(jié)果顯示RNAi-VqBAK1葉片出現(xiàn)黃化和廣泛壞死。DAB和臺(tái)盼藍(lán)染色顯示，與WT葉片相比，RNAi-VqBAK1葉片中H₂O₂顯著爆發(fā)并出現(xiàn)廣泛的細(xì)胞死亡。抗氧化酶活性測(cè)定表明SOD水平?jīng)]有變化，而CAT活性在RNAi-VqBAK1葉片中相對(duì)于WT葉片顯著降低。這些結(jié)果表明，VqBAK1通過(guò)調(diào)節(jié)CAT活性來(lái)清除過(guò)量的H₂O₂積累，從而防止葡萄葉片在接種E. necator后發(fā)生細(xì)胞死亡。

為了進(jìn)一步闡明VqBAK1控制葡萄細(xì)胞死亡的機(jī)制，使用TurboID介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記技術(shù)來(lái)鑒定互作蛋白質(zhì)。基于這些結(jié)果，我們從ROS通路中選擇了氧化還原酶CAT2進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。使用DUAL膜系統(tǒng)，證明了VqBAK1與VqCAT2在酵母細(xì)胞中的相互作用。該相互作用通過(guò)BiFC、split-LUC和Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，我們檢測(cè)了VqBAK1和VqCAT2的共定位。結(jié)果表明VqCAT2定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核。當(dāng)VqBAK1-cherry與VqCAT2-GFP共表達(dá)時(shí)，在細(xì)胞膜和核膜上均觀察到共定位。這些發(fā)現(xiàn)表明VqBAK1可能通過(guò)細(xì)胞相互作用影響VqCAT2的功能活性。為了研究VqCAT2在葡萄中的功能，我們?cè)凇甌hompson Seedless’葉片中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)和RNA干擾VqCAT2，并在接種后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量其表達(dá)。在接種后7天，與空載體（OE和RNAi）和過(guò)表達(dá)葉片相比，RNAi-VqCAT2葉片出現(xiàn)壞死。此外，在接種后3天，RNAi-VqCAT2葉片中的H₂O₂積累更明顯，而過(guò)表達(dá)葉片僅顯示最小積累。我們還檢測(cè)了RNAi-VqBAK1株系在接種E. necator后VqCAT2的表達(dá)。從接種后0到3天，RNAi株系中VqCAT2的表達(dá)持續(xù)增加，但仍顯著低于野生型。這些發(fā)現(xiàn)表明，VqCAT2在接種E. necator后正向清除H₂O₂水平。

G型LecRK已在多種植物物種中被廣泛鑒定和表征，在水稻、擬南芥和玉米中，它們?cè)谥参锟共⌒灾衅鹬�關(guān)鍵作用。然而，關(guān)于G型LecRK在葡萄抗性中的研究在很大程度上仍未探索，迄今為止尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究。在本研究中，我們首次對(duì)葡萄中的G型LecRK進(jìn)行了功能分析，證明沉默VqLecRKV.4會(huì)顯著損害葡萄對(duì)白粉病的抗性，而過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)抗性。這些發(fā)現(xiàn)與先前在其他植物物種中的研究一致。

ROS對(duì)植物免疫至關(guān)重要，驅(qū)動(dòng)程序性細(xì)胞死亡（PCD）和過(guò)敏反應(yīng)（HR）以限制病原體傳播，特別是對(duì)于生物營(yíng)養(yǎng)型病原體。G型LecRK已被證明可以調(diào)節(jié)ROS積累和細(xì)胞死亡，充當(dāng)ROS積累的負(fù)向或正向調(diào)節(jié)因子。在本研究中，我們證明VqLecRKV.4通過(guò)積累更高水平的H₂O₂來(lái)正向調(diào)節(jié)葡萄對(duì)白粉病的抗性。SOD通過(guò)調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的H₂O₂水平，在增強(qiáng)抗病性方面具有關(guān)鍵影響。在這里，我們證實(shí)了VqLecRKV.4與ROS相關(guān)酶VqCu/ZnSOD1在體外和植物體內(nèi)的相互作用，并且上調(diào)VqCu/ZnSOD1表達(dá)會(huì)增加葡萄葉片在感染E. necator后H₂O₂的積累。此外，我們發(fā)現(xiàn)VqLecRKV.4通過(guò)增加包括VqCu/ZnSOD1在內(nèi)的ROS相關(guān)酶的磷酸化水平，正向調(diào)節(jié)葡萄對(duì)白粉病的抗性。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明VqLecRKV.4通過(guò)增加VqCu/ZnSOD1的磷酸化水平，正向調(diào)節(jié)ROS積累和HR反應(yīng)，以響應(yīng)白粉病。然而，VqLecRKV.4磷酸化VqCu/ZnSOD1的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

隨著對(duì)G型LecRK研究的深入，它們與BAK1的相互作用逐漸顯現(xiàn)。在本研究中，我們驗(yàn)證了葡萄中VqLecRKV.4與VqBAK1之間的相互作用。此外，BAK1與其他RLK協(xié)同作用，可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。然而，我們的研究揭示，在VqBAK1-RNAi株系中，過(guò)表達(dá)VqLecRKV.4導(dǎo)致葡萄葉片在病原體感染后出現(xiàn)廣泛壞死。這一意想不到的現(xiàn)象凸顯了BAK1在植物免疫中的復(fù)雜作用，特別是在通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)細(xì)胞死亡方面。

植物免疫反應(yīng)的持續(xù)激活可導(dǎo)致ROS過(guò)度積累和細(xì)胞死亡反應(yīng)向病原體感染部位鄰近區(qū)域擴(kuò)散。然而，植物具有調(diào)節(jié)其防御穩(wěn)態(tài)的能力，以防止在動(dòng)物中觀察到的過(guò)度激活反應(yīng)。例如，抗氧化酶是植物中ROS解毒的關(guān)鍵因子。值得注意的是，BAK1通過(guò)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng)這些酶的活性，從而增強(qiáng)植物的抗氧化防御能力。在本研究中，我們首次對(duì)葡萄中的VqBAK1進(jìn)行了功能分析。我們觀察到，在RNAi-VqBAK1株系中，過(guò)表達(dá)VqLecRKV.4導(dǎo)致葡萄葉片在接種E. necator后H₂O₂過(guò)度積累，而CAT活性在RNAi-VqBAK1葉片中顯著減弱。此外，我們證實(shí)VqBAK1在體外和植物體內(nèi)均與VqCAT2相互作用。這些結(jié)果表明，BAK1通過(guò)與抗氧化酶相互作用，增強(qiáng)其清除H₂O₂的能力，并防止過(guò)表達(dá)VqLecRKV.4的葡萄葉片在接種后發(fā)生過(guò)度細(xì)胞死亡。VqLecRKV.4-VqBAK1模塊通過(guò)VqCu/ZnSOD1和VqCAT2對(duì)ROS進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)，這區(qū)別于先前報(bào)道的其他植物物種中的LecRK-BAK1復(fù)合物。

總而言之，我們鑒定出VqLecRKV.4是抗葡萄白粉病的重要基因。它與VqBAK1相互作用形成免疫復(fù)合物，調(diào)節(jié)葡萄對(duì)白粉病的抗性。VqLecRKV.4可能通過(guò)激活VqCu/ZnSOD1的活性，正向增強(qiáng)ROS積累和HR。同時(shí)，VqBAK1控制過(guò)表達(dá)VqLecRKV.4的葡萄葉片在接種后H₂O₂的過(guò)度積累，從而防止細(xì)胞死亡反應(yīng)向病原體感染部位鄰近區(qū)域擴(kuò)散。這個(gè)VqLecRKV.4-VqBAK1-抗氧化酶模塊為理解葡萄抗白粉病的分子機(jī)制提供了更全面的認(rèn)識(shí)，并為開發(fā)具有增強(qiáng)抗病性的葡萄品種提供了有價(jià)值的策略和遺傳資源。