人臍帶間充質干細胞（hUC-MSCs）源自本實驗室保存的第三代（P3）細胞。實驗中使用T-175培養瓶進行二維（2D）培養，常氧培養在5.0% CO₂、37°C條件下進行。二維缺氧（2D-HO）組在5.0% O₂氣氛的三氣培養箱中培養。對于三維（3D）培養，使用配備船用葉輪的1.0 L生物反應器進行hUC-MSCs擴增。溶解氧（DO）張力自動控制在40%至60%范圍內：常氧組維持在60% ± 5%，缺氧組維持在40% ± 5%。添加直徑250 μm、濃度1.0 g/L的微載體，細胞接種密度為5 – 8 × 10⁴個細胞/mL。

使用BALB/C-nu小鼠建立直徑10 mm的皮膚缺損模型。在創口形成后的第0、3、5、7天，通過皮下注射外泌體（100 μL，50 μg/mL）。在第0、3、7、10、14天拍攝傷口照片記錄愈合過程。另設實驗組，在傷口邊緣皮下注射10 nM agomir-185-5p、antagomir-185-5p、3H-EXO或3H-EXO與antagomir-185-5p的組合，于第0、2、4、6天給藥，監測14天內的傷口愈合情況。

通過差速離心法從細胞培養上清中分離外泌體：300 × g離心10分鐘，2,000 × g離心30分鐘，120,000 × g離心2小時。使用納米顆粒跟蹤分析（NTA）測定外泌體顆粒數，透射電鏡（TEM）觀察形態，蛋白質印跡法和納米流式細胞術鑒定表面標志蛋白CD63、CD9、ALIX、TSG101。

基于五個陰性標志物（CD19、CD11b、CD34、CD45、HLA-DR）和三個陽性標志物（CD73、CD90、CD105），通過流式細胞術對不同培養條件下的hUC-MSCs進行表征。

使用試劑盒誘導hUC-MSCs向成骨、成脂和成軟骨細胞分化2-3周，分別通過茜素紅染色、油紅O染色和阿利新藍染色進行鑒定。

使用β-半乳糖苷酶試劑盒對細胞進行染色，通過光鏡觀察評估細胞衰老情況。

使用EdU試劑檢測不同濃度外泌體（1, 5, 10, 20, 50 μg/mL）處理48小時后小鼠皮膚源性成纖維細胞的增殖情況。

使用Coralite Plus 488染色觀察F-actin，使用MitoTracker Red染料標記線粒體，通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。

使用ATP測定試劑盒檢測成纖維細胞的ATP含量，并通過RT?qPCR檢測與ATP合成相關基因（PGC-1^α、TFAM、NRF1、SOD2、ATP5a）的表達。

與外泌體共培養24小時后，收集成纖維細胞進行RNA轉錄組測序和分析。

使用RNA/DNA分離試劑盒從成纖維細胞中分離RNA，通過逆轉錄和qPCR定量基因水平。檢測的基因包括RhoA、YAP、TGF-β1、SMAD7、COL-I、COL-III，以及miR-185-5p、miR-423-5p、miR-320a-5p和let-7b-5p。

通過蛋白質印跡法檢測成纖維細胞中TGF-β1、α-SMA、RhoA、YAP、SMAD7、COL-I、COL-III和Hif-l^α等蛋白的表達水平。

向成纖維細胞中添加RhoA抑制劑、YAP抑制劑、YAP激活劑PY-60和外泌體，共培養24小時后，收集細胞進行WB和RT?qPCR分析，檢測COL-I、COL-III、YAP和RhoA等關鍵因子。

使用miRDB數據庫預測miR-185-5p與RhoA的結合位點。將RhoA的野生型（RhoA-NC）和突變型（RhoA-MU）3′-UTR序列克隆并插入熒光素酶報告質粒，轉染HEK-293細胞48小時后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測量熒光素酶活性。

使用ImageJ軟件和GraphPad Prism軟件進行統計分析。組間顯著差異采用t檢驗分析。采用雙因素方差分析評估兩組以上均值的統計學顯著性。所有實驗結果均來自至少三次生物學重復。數據以平均值 ± 標準差表示；p< 0.05，p< 0.01，p< 0.001，**p< 0.0001。P值小于0.05被認為具有統計學顯著性。

研究表明，5%的氧濃度是hUC-MSCs生長的臨界閾值，因此在后續缺氧培養實驗中采用5%的氧濃度。流式細胞術分析證實，超過96%的細胞群體表達CD105、CD90和CD73這三個陽性標志物，而表達CD19、CD11b、CD45、CD34和HLA-DR這五個陰性標志物的細胞群體少于2.0%，符合干細胞標準。三維缺氧（3D-HO）培養的細胞表現出更高的多向分化潛能，能產生更多礦化結節、更大更豐富的脂滴以及更大的軟骨球。此外，3D培養顯著減少了β-半乳糖苷酶的產生，抑制了細胞衰老。因此，3D懸浮培養和缺氧刺激促進了hUC-MSCs干性的改善和細胞活力的維持。

與2D常氧、2D缺氧和3D常氧培養相比，3D-HO培養獲得的外泌體（3H-EXO）中特異性陽性標志物CD9、CD63、ALIX和TSG101的水平顯著增加，并顯示出更清晰流暢的茶杯樣結構。納米顆粒跟蹤分析（NTA）也鑒定出大量細胞外囊泡顆粒。3D-HO培養中每個細胞產生的外泌體顆粒平均數分別是2D-NO、2D-HO和3D-NO培養的2.43倍、2.01倍和1.88倍。此外，3D-HO組外泌體生物發生關鍵蛋白CHMP6在基因和蛋白水平上的豐度也增加，支持3D-HO組的hUC-MSCs具有產生更多細胞外囊泡的潛力，且外泌體的數量和比例顯著增加，而非僅僅是囊泡。

在小鼠急性傷口模型中注射外泌體后，與對照組相比，3H-EXO組的傷口在第14天最早顯示出無瘢痕愈合的跡象。H&E染色顯示，在3H-EXO組中，傷口邊緣與正常皮膚之間首先形成了致密的細胞外基質（ECM），這是由于不同類型膠原（COL-I和COL-III）的重塑和交聯所致。此外，與對照組相比，缺氧外泌體組能生成更多新的毛囊結構。Masson染色結果也表明，3H-EXO能夠在第7天和第14天增加膠原蛋白總量。免疫熒光分析顯示，3D培養組在Day 7和Day 14的COL-III含量均顯著高于2D培養組和對照組。值得注意的是，第14天時，與對照組相比，COL-I水平顯著下降。3H-EXO組的COL-III/COL-I比例在第14天達到4:1。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）是肌成纖維細胞（myoFbs）的主要標志物。在Day 7的小鼠組織中，各組間的α-SMA水平沒有顯著差異，然而在Day 14時，對照組和2D培養組的α-SMA表達顯著升高。這些結果表明，3H-EXO可以通過抑制肌成纖維細胞的活化來減少COL-I的過度表達和形成，從而通過精確調控再生過程中的COL-I與COL-III比例來促進小鼠的無瘢痕傷口愈合。

EdU檢測顯示，50 μg/mL外泌體處理2小時后對增殖的影響最顯著，與對照組相比增加了1.94倍。F-actin熒光染色表明，3H-EXO處理促進了F-actin的增加，提示細胞處于活躍的生長或運動狀態。MitoTracker檢測和ATP含量測定結果顯示，3D培養的外泌體增加了線粒體膜電位和ATP含量。此外，PGC-1^α、TFAM、NRF1和ATP5A等與線粒體合成和功能相關的基因表達在3H-EXO處理后也顯著改善。然而，通過低ATP干預實驗發現，僅3H-EXO組能在能量狀態變化下對膠原亞型比例產生特異性調節，這表明外泌體對膠原亞型比例的定向改變是由外泌體內包裹的特定信號分子——尤其是miRNA——驅動的。

為了探索外泌體調控成纖維細胞中膠原形成的機制，對經外泌體處理的成纖維細胞進行了RNA測序、蛋白質印跡和RT?qPCR分析。主成分分析（PCA）顯示各組間具有高度一致性和可重復性。與2H-EXO/對照組相比，3H-EXO/2H-EXO組中差異表達基因在與細胞外基質合成、沉積、細胞表面受體結合、流體剪切應力相關通路以及纖維化疾病相關通路方面富集程度更高。KEGG和Reactome通路分析表明，TGF-β信號通路和Hippo信號通路是與3H-EXO組膠原合成直接相關的關鍵信號通路。RT?qPCR和蛋白質印跡分析結果顯示，3H-EXO組中RhoA、YAP、COL-I、TGF-β1和α-SMA的水平顯著降低，而SMAD7和COL-III的水平升高。YAP是Hippo和TGF-β信號通路中的共同因子，受上游RhoA蛋白調控。用RhoA和YAP抑制劑處理成纖維細胞的蛋白質印跡分析顯示，與3H-EXO組相比，COL-I水平升高，COL-III水平降低，這表明RhoA和YAP可能都參與了抑制COL-I形成和促進COL-III產生的過程。1.5) and blue (FC < 1.5) data points represent genes with the indicated fold change in expression and a false discovery rate (FDR) < 0.05. Functional overrepresentation analysis using differentially expressed genes for the 2H-EXO versus control and 3H-EXO versus 2H-EXO comparison groups with the (e, f) KEGG and (g, h) Reactome databases. Statistical analysis of (i) TGF-β1, (j) α-SMA, (k) RhoA, (l) YAP, (m) SMAD7, (n) COL-I, (o) COL-III, and (p) HiF-1α gene expression determined via RT?qPCR.">

miRNA測序分析發現，在3H-EXOs與2H-EXOs之間，共有14個miRNA存在顯著差異表達，其中miR-423-5p、miR-320a-5p、miR-185-5p和let-7b-5p在測序數據集中豐度最高。后續定量分析顯示，3D培養顯著增強了這些候選miRNA的富集，缺氧刺激產生了額外的協同效應。體外功能評估發現，與其他三種miRNA相比，只有miR-185-5p具有明顯的膠原調節作用。這些發現表明，3D-HO培養促進了功能富集外泌體的產生，有助于改善傷口愈合效果。

雙熒光素酶報告基因檢測證實了miR-185-5p能夠靶向RhoA基因。將miR-185-5p模擬物和抑制劑轉染人皮膚成纖維細胞共培養48小時后，免疫熒光定量分析顯示，miR-185-5p模擬物和EXO組在調控COL-I和COL-III方面表現出相同趨勢，而單獨的miR-185-5p抑制劑組則呈現相反趨勢。miR-185-5p和EXO組中α-SMA的減少進一步驗證了miR-185-5p對COL-I的抑制作用。鑒于miR-185-5p靶向RhoA，基于模擬物和抑制劑的實驗支持了RhoA在膠原調控中的關鍵作用。此外，與YAP激活劑共培養的結果證實了YAP信號對膠原亞型形成的貢獻。具體而言，與miR-185-5p模擬物或外泌體處理相比，YAP激活誘導了COL-I和α-SMA水平的顯著增加。相應地，RhoA和YAP下游的基因表達水平也發生了不同程度的變化。在RhoA和YAP的mRNA表達水平上，EXO組和miR-185-5p模擬物組均呈下降趨勢，證明了miR-185-5p對細胞中RhoA/YAP活性的調節作用。蛋白質印跡分析也顯示，miR-185-5p抑制了人成纖維細胞中RhoA/YAP蛋白水平的表達，趨勢與mRNA表達一致。

同樣，將agomir-185-5p和antagomir-185-5p注射到小鼠皮膚傷口中。結果顯示，agomir-185-5p組的傷口在第14天最早接近愈合。此外，agomir-185-5p和EXO組皮下再生厚度較antagomir-185-5p組更薄，并且包含更多毛囊結構。agomir-185-5p組的COL-I含量顯著下降，COL-III/COL-I比例接近6，而加入antagomir-185-5p則逆轉了COL-I的增加。同時，agomir-185-5p組中RhoA和YAP的表達也顯著降低，進一步證實了體內實驗的結果，即miR-185-5p–RhoA/YAP軸靶向調控COL-I和COL-III，從而促進無瘢痕傷口愈合。

本研究結果表明，3D-HO培養顯著提高了人臍帶間充質干細胞（hUC-MSCs）源外泌體的產量和功能質量。為更好地模擬體內生理生長條件，研究首次提出并建立了3D-HO共培養策略，同時提高了外泌體的分泌效率和急性傷口的愈合效果。與傳統培養條件相比，3D-HO微環境更好地模擬了細胞間以及細胞與ECM間的生理相互作用，從而重塑了細胞的代謝、極性和分泌程序。在此條件下，hUC-MSCs的細胞活性增強，干細胞特性得以維持，衰老延遲，并且每個細胞系的外泌體產量顯著增加。

此外，miRNA譜分析顯示，miR-185-5p在3D缺氧外泌體中顯著富集，這表明該培養策略不僅放大了外泌體分泌，還促進了功能相關分子的裝載。該研究揭示了miR-185-5p在控制膠原亞型比例和重建ECM方面的新作用。用miR-185-5p模擬物和agomir-185-5p處理成纖維細胞和小鼠傷口組織的結果，均證實了miR-185-5p在膠原調控中的積極作用。

在眾多影響膠原再生的機制中，研究發現RhoA/YAP受到miR-185-5p的調控，并參與膠原亞型的調控。進一步抑制實驗表明，阻斷RhoA/YAP活性對膠原亞型比例有積極影響。研究還揭示了miR-185-5p可以與RhoA的3’UTR結合，從而靶向抑制RhoA及其下游對YAP的抑制作用。用YAP激活劑處理成纖維細胞的結果驗證了YAP在膠原亞型平衡中的關鍵作用。因此，本研究揭示了通過miR-185-5p重置機械轉導軸（RhoA/YAP）改變了傷口修復過程中的ECM組成。

本研究建立了一種用于培養臍帶間充質干細胞以分泌功能性外泌體的3D-HO懸浮培養系統。值得注意的是，在此條件下產生的外泌體通過靶向成纖維細胞中的RhoA/YAP信號軸來調控COL-III/COL-I的再生比例，從而從源頭上預防增生性瘢痕形成，在急性傷口修復中展現出顯著療效。在這些外泌體中，miR-185-5p成為主要的關鍵調控分子，并在3D-HO外泌體中高度富集。因此，本研究提出了一種模擬體內微環境的、開創性的工業規模干細胞培養工藝，產生了一種促進皮膚無瘢痕愈合的新型生物材料。