工程菌-脂質(zhì)體復(fù)合體HRB@LC：通過(guò)協(xié)同阻斷CD47-SIRPα通路與激活STING信號(hào)增強(qiáng)腫瘤免疫治療
《Advanced Science》：Engineered Bacteria Factory Integrating Drug Delivery and Antibody Manufacture for Activating the STING Signal Pathway Mediated Tumor Immunotherapy
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【編者推薦】本研究報(bào)道了一種創(chuàng)新的腫瘤免疫治療平臺(tái)——缺氧響應(yīng)工程菌（HRB）與裝載STING激動(dòng)劑cGAMP的響應(yīng)性脂質(zhì)體（LC）的復(fù)合體HRB@LC。該平臺(tái)利用合成生物學(xué)與材料工程學(xué)手段，實(shí)現(xiàn)了免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）抗體在腫瘤部位的原位合成，并協(xié)同激活STING信號(hào)通路，有效阻斷CD47-SIRPα介導(dǎo)的免疫逃逸，重塑腫瘤免疫微環(huán)境，在皮下及原位乳腺癌小鼠模型中展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果，為聯(lián)合免疫治療提供了新范式。
摘要與機(jī)制
本研究開發(fā)了一種集成的工程菌藥物遞送與抗體制造平臺(tái)：HRB@LC。該復(fù)合體由缺氧響應(yīng)工程菌（HRB）與共價(jià)連接在其表面的cGAMP裝載脂質(zhì)體（LC）構(gòu)成。HRB可在腫瘤缺氧微環(huán)境（TME）中特異性表達(dá)并分泌CD47抗體（aCD47），從而在腫瘤部位原位合成免疫檢查點(diǎn)抑制劑，阻斷CD47-SIRPα介導(dǎo)的“別吃我”信號(hào)，解除巨噬細(xì)胞的免疫抑制。同時(shí)，LC能在腫瘤弱酸性TME中響應(yīng)釋放，被巨噬細(xì)胞吞噬。其包裹的STING激動(dòng)劑cGAMP可激活細(xì)胞內(nèi)STING信號(hào)通路，誘導(dǎo)I型干擾素（IFN-β）表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化、樹突狀細(xì)胞（DCs）成熟及T細(xì)胞浸潤(rùn)與激活。該策略旨在通過(guò)協(xié)同阻斷免疫逃逸和激活先天免疫，重塑TME，產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
結(jié)果與討論
1. HRB@LC的制備與表征
研究成功構(gòu)建了包含缺氧啟動(dòng)子fdhF、aCD47基因及報(bào)告基因mCherry的重編程質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至減毒大腸桿菌MG1655中獲得HRB。在缺氧條件下，HRB能穩(wěn)定表達(dá)并分泌aCD47，而常氧條件下表達(dá)量極低，證實(shí)了其缺氧響應(yīng)特性。
同時(shí)，采用薄膜水化法制備了表面修飾醛基的cGAMP響應(yīng)性脂質(zhì)體（LC）。透射電鏡（TEM）顯示LC呈均勻球形，水合粒徑約218 nm。通過(guò)希夫堿反應(yīng)，LC表面的醛基與HRB表面的氨基共價(jià)連接，形成復(fù)合體HRB@LC。共聚焦顯微鏡與熒光共定位分析證實(shí)了LC在HRB表面的成功負(fù)載，且該連接在弱酸性環(huán)境中可響應(yīng)性解離，實(shí)現(xiàn)LC的靶向釋放。
2. HRB@LC的腫瘤靶向與穿透能力
在4T1細(xì)胞球體模型中，HRB@LC保持了與HRB相當(dāng)?shù)纳顚哟┩改芰ΑＰ∈篌w內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)表明，靜脈注射HRB@LC后，其能高效靶向并富集于腫瘤部位，熒光信號(hào)可維持至24小時(shí)，且主要定植于腫瘤組織，在其他正常器官中分布極少。此外，LC的負(fù)載不影響HRB的增殖能力及aCD47的表達(dá)分泌功能。
3. HRB@LC激活巨噬細(xì)胞STING通路并阻斷“CD47-SIRPα”信號(hào)
體外實(shí)驗(yàn)證明，HRB@LC在弱酸性環(huán)境中釋放的LC可被巨噬細(xì)胞有效吞噬。ELISA和RT-qPCR檢測(cè)顯示，處理后的巨噬細(xì)胞中IFN-β及其編碼基因Ifnb1的表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)Western blot證實(shí)了磷酸化IRF3（p-IRF3）和TBK1（p-TBK1）水平增加，表明STING信號(hào)通路被成功激活。此外，趨化因子CCL-5的表達(dá)也增加，提示其具有招募T細(xì)胞的潛力。
另一方面，由缺氧HRB分泌的aCD47能有效阻斷CD47-SIRPα相互作用。在4T1細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)缺氧HRB上清處理的腫瘤細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬的比例顯著提高，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步量化了吞噬效率，證實(shí)aCD47成功解除了對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的抑制。
4. HRB@LC抑制腫瘤生長(zhǎng)并激活抗腫瘤免疫反應(yīng)
在皮下和原位乳腺癌小鼠模型中，HRB@LC治療組（G4）顯示出最強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果，腫瘤體積和重量顯著低于PBS、游離LC、MG1655@LC（負(fù)載LC的野生型菌）及HRB@Lip（負(fù)載空脂質(zhì)體的HRB）等對(duì)照組，且未引起小鼠體重顯著變化或主要器官病理?yè)p傷，表明其良好的生物安全性。腫瘤組織切片TUNEL和Ki-67染色顯示HRB@LC組細(xì)胞凋亡增加、增殖減少。
免疫學(xué)分析表明，HRB@LC治療顯著提高了腫瘤組織中M1型巨噬細(xì)胞（CD86+）、成熟DCs（CD80+CD86+）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD3+CD8+）的浸潤(rùn)水平。腫瘤組織RT-qPCR結(jié)果顯示，IFN-β、CCL-5、IL-6、TNF-α及IFN-γ等免疫刺激因子的基因表達(dá)顯著上調(diào)，證實(shí)了治療重塑了免疫抑制性TME，激活了系統(tǒng)性抗腫瘤免疫。
5. HRB@LC抑制原位乳腺癌及肺轉(zhuǎn)移
在利用4T1-LUC細(xì)胞建立的原位乳腺癌及肺轉(zhuǎn)移模型中，HRB@LC治療同樣有效抑制了原位腫瘤的生長(zhǎng)。更重要的是，長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，HRB@LC能顯著抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移，其肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量遠(yuǎn)少于其他各組。流式分析顯示，HRB@LC治療組小鼠脾臟中細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD4?CD8+）比例最高，提示其可能誘導(dǎo)了長(zhǎng)效的免疫記憶反應(yīng)，從而有效控制轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)展。
結(jié)論與展望
本研究成功構(gòu)建了工程菌-脂質(zhì)體復(fù)合平臺(tái)HRB@LC，該平臺(tái)結(jié)合了合成生物學(xué)與納米技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了免疫檢查點(diǎn)抑制劑的腫瘤原位合成與STING信號(hào)通路的協(xié)同激活，在動(dòng)物模型中展現(xiàn)出卓越的抗腫瘤療效與生物安全性。該“工程菌工廠”平臺(tái)具有模塊化設(shè)計(jì)的潛力，未來(lái)可通過(guò)更換質(zhì)粒編碼序列表達(dá)不同抗體（如aPD-L1、aCTLA4等），或利用脂質(zhì)體遞送其他免疫激動(dòng)劑，為腫瘤聯(lián)合免疫治療提供了具有廣闊前景的新策略。
