《Advanced Science》：RIPK3 Orchestrates Scar-Associated Macrophage Dysfunction to Drive Pulmonary Fibrosis
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本文原創性研究發現，受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）通過非壞死性途徑調控瘢痕相關巨噬細胞（SAMs）的功能，驅動肺纖維化進程。RIPK3在SAMs中被轉化生長因子β（TGF-β）上調，進而激活PI3K-AKT-mTOR通路，促進精氨酸代謝向多胺合成偏移，最終維持骨橋蛋白（SPP1）等高表達并激活成纖維細胞。該研究突破了RIPK3傳統壞死性功能認知，為特發性肺纖維化（IPF）提供了新的免疫代謝干預靶點。
研究背景與問題
特發性肺纖維化（IPF）是一種進行性且致命的間質性肺病，以肺功能下降和細胞外基質過度沉積為特征，患者中位生存期僅2-4年。現有抗纖維化藥物吡非尼酮和尼達尼布雖能延緩疾病進展，但總體生存獲益有限。受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）作為壞死性凋亡的核心執行者，其非壞死性功能在纖維化中的作用尚不明確。本研究旨在系統揭示RIPK3在肺纖維化中的免疫代謝調控新機制。
RIPK3在IPF患者及小鼠模型中表達上調
通過對公共基因表達數據庫（GEO）的生物信息學分析，發現IPF患者肺組織和外周血中RIPK3的mRNA水平顯著上調。在博來霉素（BLM）誘導的小鼠肺纖維化模型中，纖維化肺組織中RIPK3蛋白表達也顯著升高。免疫熒光染色顯示，RIPK3在肺組織中整體高表達，并富集于巨噬細胞。進一步分選肺巨噬細胞證實，纖維化肺中巨噬細胞內的RIPK3表達被強烈誘導。流式細胞術分析表明，在纖維化條件下，間質巨噬細胞（IMΦ）擴增，提示巨噬細胞可能是RIPK3介導病理效應的關鍵靶細胞類型。
巨噬細胞特異性敲除RIPK3減輕BLM誘導的肺損傷與纖維化
為了闡明RIPK3在巨噬細胞中的具體功能，研究人員構建了巨噬細胞特異性RIPK3敲除小鼠模型（Ripk3-CKO）。在高劑量BLM（2 mg/kg）誘導的肺損傷模型中，Ripk3-CKO小鼠表現出更少的體重下降、更高的存活率以及更低的肺指數。其肺組織中炎癥因子（Tnf-α、Il-6、Il-12）和纖維化相關基因（Col1a1、Col3a1、Fn1）的mRNA表達均顯著降低。組織病理學染色顯示，Ripk3-CKO小鼠肺組織損傷顯著減輕，膠原沉積區域明顯減少。
在低劑量BLM（0.85 mg/kg）誘導的慢性肺纖維化模型中，Ripk3-CKO小鼠的體重損失更小，呼吸功能參數（如增強間歇Penh、潮氣量TV等）得到改善，微型計算機斷層掃描（Micro-CT）顯示肺部高密度區域減少。此外，肺指數、羥脯氨酸含量以及纖維化相關基因表達均顯著降低，組織學檢查也證實了纖維化程度減輕。
RIPK3缺陷減弱肺纖維化中巨噬細胞的促纖維化表型
傳統M1/M2極化模型無法完全解釋RIPK3對巨噬細胞功能的調控。通過單細胞組合索引RNA測序（sci-RNA-seq）技術，研究人員解析了肺纖維化過程中單核吞噬細胞的異質性，鑒定出五個亞群：肺泡巨噬細胞（AMs）、間質巨噬細胞（IMs）、瘢痕相關巨噬細胞（SAMs）、Ly6C-單核細胞和Ly6C+單核細胞。偽時間軌跡分析顯示，SAMs是Ly6C-和Ly6C+單核細胞向肺泡巨噬細胞分化過程中的一個關鍵細胞樞紐。基因集富集分析（GSEA）表明，SAMs是一個具有強遷移和吞噬能力的免疫活化細胞群。在Ripk3-CKO小鼠中，SAMs的比例顯著降低，其吞噬和細胞運動相關特征通路受到抑制，表明RIPK3是建立和維持SAMs活化表型的重要調控因子。
RIPK3敲除抑制SAMs的促纖維化功能
SAMs的特征標志基因包括Spp1和Arg1。在體內外實驗中，RIPK3缺失均能顯著抑制TGF-β誘導的Spp1、Arg1及Cx3cr1表達上調。機制上，這一調控不依賴于RIPK3的激酶活性及其介導的壞死性凋亡，因為未檢測到MLKL或RIPK3的磷酸化，且RIPK1/3激酶活性抑制劑無法重現RIPK3缺陷的表型。功能上，TGF-β活化的野生型SAMs能顯著誘導共培養的原代肺成纖維細胞中Col1a1、Fn1等基因表達上調及纖連蛋白FN1沉積，而RIPK3缺陷的SAMs則喪失了這種促纖維化能力。
RIPK3調控SAMs中的精氨酸代謝與多胺生物合成
代謝通路分析提示，Ripk3-CKO的SAMs中“精氨酸和脯氨酸代謝”相關通路下調。通過液相色譜-質譜聯用（LC-MS）對肺巨噬細胞及體外誘導的SAMs進行代謝組學分析，發現纖維化肺中巨噬細胞內的精氨酸含量降低，而其下游代謝產物（肌酸、鳥氨酸、脯氨酸、精胺、亞精胺、瓜氨酸）積累。在Ripk3-CKO小鼠中，精氨酸水平部分恢復，下游代謝物積累減少。體外實驗進一步證實，TGF-β特異性激活了SAMs中的多胺合成通路，導致鳥氨酸消耗和精胺、亞精胺的異常積累，而RIPK3缺失抑制了這一過程。同時，TGF-β誘導的多胺合成關鍵限速酶Odc1和Sms的表達上調也被RIPK3缺失所阻斷。
RIPK3通過PI3K-AKT-mTOR通路調控SAMs功能
研究表明，RIPK3缺失并不影響TGF-β誘導的SMAD2/3磷酸化及核轉位，說明其通過非經典途徑發揮作用。RIPK3缺失顯著抑制了TGF-β誘導的AKT、p70S6K和4E-BP1的磷酸化，表明RIPK3是PI3K-AKT-mTOR通路激活的關鍵上游調控因子。救援實驗證實，外源性補充多胺能恢復RIPK3缺陷SAMs中標志基因的表達；而在野生型SAMs中使用PI3K抑制劑阻斷AKT通路，則能重現RIPK3缺陷的表型。這些結果共同支持了一條線性信號軸：TGF-β誘導的RIPK3活化位于PI3K-AKT上游，驅動精氨酸-多胺代謝重編程。
肺組織特異性敲低RIPK3改善BLM誘導的肺纖維化
為了驗證靶向RIPK3的治療潛力，研究人員通過氣管內滴注腺病毒載體，在Ripk3flox/flox小鼠肺組織中實現了RIPK3的特異性敲低（Ripk3-KD）。結果表明，肺特異性敲低RIPK3能顯著減輕BLM誘導的纖維化表型，包括減少體重下降、降低羥脯氨酸含量、減輕膠原沉積，并下調纖維化相關基因的表達。這為RIPK3作為IPF治療靶點提供了實驗概念驗證。
總結與展望
本研究揭示了一條全新的、獨立于壞死性凋亡的免疫代謝軸。在肺纖維化過程中，TGF-β上調SAMs中的RIPK3表達。RIPK3以激酶非依賴性方式，招募并激活PI3K-AKT-mTOR信號級聯，從而驅動精氨酸代謝向多胺合成偏移。產生的多胺累積則維持了SPP1的高表達和分泌。分泌的SPP1和多胺以旁分泌方式激活成纖維細胞，促進肌成纖維細胞分化，最終驅動不可逆的肺組織重塑。這一發現擴展了RIPK3的生物學功能認知，強調了其作為纖維化生態位關鍵代謝調控因子的作用，并為通過靶向巨噬細胞代謝重編程來治療IPF等纖維化疾病提供了有前景的新策略。未來的研究可探索此通路在其他器官纖維化中的普適性，并開發針對該免疫代謝軸的精準治療工具。
