《Advanced Science》：Multi-Level Confinement Single-Molecule Charge Transfer Activated PRET for Near-Infrared Targeted Cell Imaging
編輯推薦：
本工作報道了一種具有大斯托克斯位移（320 nm）和近紅外（NIR）延遲熒光發射的磷光共振能量轉移（PRET）體系，通過構建由剛性二芐基橋連的吡啶鹽衍生物（G1）、葫蘆[8]脲（CB[8]）和β-環糊精接枝的透明質酸（HACD）組成的電荷轉移超分子組裝體，實現了單分子PRET過程，將500 nm磷光擴展至650 nm近紅外延遲熒光（壽命達11.20 μs），并成功應用于活細胞線粒體靶向成像，為細胞成像、信息加密和防偽等領域提供了新策略。
1 Introduction
近年來，近紅外（NIR）發光材料因其出色的深層組織穿透能力、快速響應速度和低背景干擾，在傳感器、生物成像、疾病診療和光催化生物正交化學等領域應用廣泛。然而，傳統的NIR發光材料通常面臨諸多挑戰，如繁瑣的化學合成與發色團修飾、低量子效率以及熱猝滅。利用環糊精、柱芳烴和葫蘆脲等超分子大環主體封裝NIR發色團，已被證實是改善NIR發光材料光物理性質的有效策略。此外，基于熒光/磷光共振能量轉移（FRET/PRET）的人工光捕獲系統，能將能量從激發單重態/三重態的供體發射體轉移到發色團受體的單重態，被認為是將發射擴展到NIR區域的一種引人注目的方案。然而，除了光譜重疊外，實現FRET/PRET還需要供體/受體的空間鄰近性以及合適的躍遷偶極矩取向。在這方面，大環限域和超分子級聯組裝不僅可以通過限制分子運動來抑制非輻射躍遷導致的能量損失，從而促進磷光的產生，還能使能量供體和受體在空間上更接近并穩定單重態/三重態激子，從而增強FRET/PRET的可能性。盡管通過FRET構建近紅外發光材料已取得實質性進展，但大多數基于供體-受體摻雜的異質系統存在諸如能量轉移距離不利、信噪比差以及穩定性令人擔憂等缺點。而具有單一電子供體/受體對的單分子熒光共振能量轉移，其轉移效率直接由分子內供體-受體距離和偶極取向決定，表現出靈敏且穩定的信號以及強大的抗干擾能力，在先進NIR材料設計中廣受歡迎。然而，據我們所知，通過多級大環限域在電荷轉移復合物中實現NIR延遲熒光發射，并通過電荷轉移相互作用調控PRET過程的單分子磷光共振能量轉移則鮮有報道。
在本工作中，我們報道了一種基于多級大環限域的高效單分子PRET系統，該系統由剛性二芐基橋連的吡啶鹽衍生物（G1）、葫蘆[8]脲（CB[8]）和β-環糊精（β-CD）修飾的透明質酸（HACD）構建而成，具有320 nm的大斯托克斯位移和NIR延遲熒光發射，可用于靶向癌細胞成像。得益于葫蘆[8]脲的限域效應有效促進了系間竄越過程并抑制了分子振動和猝滅劑引起的非輻射躍遷，CB[8]和G1的二元組裝激活了溴苯基吡啶單元在約500 nm處的強烈磷光發射。通過與HACD進一步組裝，利用β-CD對蒽基的限域效應以及與HA的靜電相互作用，實現了從苯基吡啶單元到蒽基吡啶部分的分子內PRET過程，同時伴隨著拓撲形態從納米棒向囊泡的轉變，具有良好的細胞滲透性，最終在650 nm處產生壽命為11.20 μs的NIR延遲熒光。利用HACD的腫瘤靶向特性，這種具有大斯托克斯位移和長壽命NIR光致發光的三元超分子組裝體成功應用于癌細胞的線粒體靶向成像。
2 Results and Discussion
G1通過兩步Mizoroki-Heck反應/烷基取代反應合成，并通過核磁共振（1H NMR, 13C NMR）和高分辨率質譜充分表征。首先，進行紫外-可見（UV-vis）滴定實驗以研究G1與CB[8]之間的結合行為。隨著CB[8]的加入，G1的紫外-可見光譜顯示出其從467 nm到518 nm的特征電荷轉移吸收持續紅移，并在加入1.0當量CB[8]后趨于穩定，表明G1以1:1的化學計量比被封裝到CB[8]的空腔中，并且由于CB[8]的穩定作用，蒽基作為供體與吡啶鹽作為受體之間的電荷轉移相互作用顯著增強。G1與CB[8]之間1:1的化學計量結合比通過Job's plot實驗得到證實，并且根據通過非線性最小二乘公式擬合的紫外-可見吸收滴定，確定結合常數為5.49 × 106M?1。此外，進行了1H NMR和2D NMR光譜分析以推斷G1和CB[8]之間的結合模式。1H NMR譜顯示，蒽基吡啶鹽上的質子（α’ 和 β’）幾乎發生了顯著的低場位移，而溴苯基吡啶鹽上的質子（α 和 β）則向高場位移，表明曲折的G1傾向于以頭對尾的結合模式，通過CB[8]空腔對溴苯基吡啶單元進行末端封裝。同時，客體分子G1的擴散系數（D = 2.66 × 10?10m/s2）比組裝體G1/CB[8]（D = 9.37 × 10?11m/s2）大一個數量級，這進一步驗證了G1/CB[8]形成了n:n頭對尾超分子準輪烷。相應地，采用透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）來揭示主客體絡合后拓撲結構的變化。游離的客體分子G1呈現出長度約為3 μm的螺旋納米纖維，這可能歸因于分子間電荷轉移相互作用驅動的隨機自組裝。相比之下，CB[8]的加入將G1的纖維狀拓撲結構轉變為長度在200-1000 nm不等的納米棒，這與準輪烷的有序頭對尾組裝模式一致。
在充分表征G1和G1/CB[8]之后，探索了它們的光致發光性質。G1在470 nm激發下顯示出650 nm的熒光發射，在延遲光譜中沒有捕獲到明顯的磷光信號。加入1.0當量的CB[8]后，650 nm處的熒光發射峰增強，并且在延遲光譜中，在330 nm激發下，500 nm處出現發射峰信號，這對應于CB[8]對溴苯基吡啶單元的限域效應以及由線性剛性層層組裝形成的超分子納米結構對三重態猝滅劑的有效屏蔽作用。由于G1中的兩個組分（溴苯基吡啶單元和蒽基吡啶單元）分別在330 nm和470 nm激發下出現500 nm的磷光發射和650 nm的熒光發射，從而滿足了供體和受體之間光譜充分重疊的要求，我們探索了單分子磷光能量共振轉移體系的構建。首先，合成了參考化合物BrPY和BP4VA-1，通過簡單地物理混合能量供體和受體來研究磷光行為。由于CB[8]對客體的限域效應促進了系間竄越過程并抑制了非輻射躍遷，參考分子BrPY在與CB[8]組裝后，在500 nm附近顯示出強烈的室溫磷光（RTP）發射，壽命為372.26 μs。由470 nm激發的BP4VA-1的穩態光致發光（PL）譜顯示在650 nm處有一個發射峰，測量的納秒壽命為0.55 ns，揭示了蒽基吡啶單元的純熒光特性。當供體/受體比例從20:1增加到1:1時，受體在650 nm處的NIR延遲熒光發射強度逐漸增強，而500 nm處的磷光壽命從171.02 μs減少到25.69 μs，暗示了BrPY/CB[8]與BP4VA-1之間的PRET過程。然而，在330 nm激發下，G1/CB[8]未能表現出650 nm的延遲熒光發射。
為了實現單分子磷光共振能量轉移并提高生物成像的生物相容性，引入了β-環糊精接枝的透明質酸（HACD）與G1/CB[8]構建三元超分子組裝體。利用HA的高負電荷密度以及接枝的β-CD通過疏水效應對芳基進行封裝，我們假設在二次組裝后進一步限制主客體復合物可以抑制非輻射躍遷，并使能量供體和受體在空間上更接近，從而增強發生PRET過程的可能性。正如預期的那樣，隨著向G1/CB[8]溶液中加入HACD，500 nm處的磷光發射逐漸減弱，同時延遲光譜中在650 nm處出現了一個新的發射峰，并在HACD含量為0.045 mg/mL時趨于穩定。在確定了HACD的最佳含量（0.045 mg/mL）后，我們探索了G1/CB[8]@HACD的二次組裝行為和光物理性質。G1/CB[8]@HACD的TEM圖像顯示其拓撲結構從納米棒轉變為囊泡，其尺寸與動態光散射（DLS）測量中752 nm的平均流體動力學直徑相匹配。同時，在G1/CB[8]@HACD溶液中也觀察到了明顯的丁達爾效應，表明形成了超分子納米組裝體。此外，G1和G1/CB[8]具有+2.58和+3.31 mV的正zeta電位，隨著HACD的加入，該電位轉變為-0.135 mV，揭示了通過靜電相互作用成功構建了三元超分子組裝體。為了驗證HACD與蒽基之間的相互作用，選擇BP4VA-1和β-CD作為模型化合物，并通過1H NMR譜研究了它們的結合行為。加入β-CD后，BP4VA-1上蒽基的質子（He, Hf）向低場移動，表明蒽基單元被封裝到β-CD的空腔中。此外，HACD的加入有效延長了BP4VA-1的熒光壽命，推斷HACD可以穩定BP4VA-1的單重態激子，從而進一步增強了PRET的可能性。相應地，由330 nm激發的G1/CB[8]@HACD組裝體在500 nm處顯示出壽命為196.73 μs的磷光發射，以及在650 nm處為中心的、壽命為11.20 μs的主要發射帶，這歸因于通過PRET過程產生的蒽基吡啶單元的延遲熒光。然而，在450 nm激發下，G1、G1/CB[8]和G1/CB[8]@HACD均顯示出650 nm的熒光發射，其壽命分別測量為0.56、0.63和0.77 ns，證實了由HACD介導的在650 nm處的NIR延遲熒光是通過PRET過程實現的，而不是通過直接激發能量受體。此外，在氮氣氣氛下，G1/CB[8]@HACD水溶液在500 nm處的壽命從196.73 μs顯著增加到323.73 μs，磷光發射強度增加了四倍，并且通過PRET過程在650 nm處的延遲熒光壽命也從11.2 μs增加到20.48 μs，這是由于避免了氧氣引起的三重態電子猝滅。
隨后，進行了時間依賴密度泛函理論（TD-DFT）計算，以進一步探索G1/CB[8]@HACD中PRET的機制。結果表明，CB[8]的限域效應穩定了耦合二聚體的激發態，導致最高占據分子軌道（HOMO）和最低未占分子軌道（LUMO）之間的能隙從4.06 eV減小到3.46 eV，并且低能吸收帶發生紅移，這與實驗光譜結果一致。值得注意的是，在與G1/CB[8]組裝時，用帶正電荷的ε-聚賴氨酸或中性的PEG替換帶負電荷的HACD均未能增強650 nm處的NIR發射，表明靜電相互作用在G1/CB[8]@HACD的實際結構中起著至關重要的作用，并促進了單分子PRET。此外，透明質酸酶對HACD的降解可以誘導G1/CB[8]@HACD的解組裝，拓撲結構從囊泡轉變回納米棒，從而實現了單分子PRET的動態調控。隨著與透明質酸酶共孵育時間的增加，G1/CB[8]@HACD在650 nm處的延遲熒光信號顯著下降。同時，500 nm處的磷光發射呈現出初始恢復和隨后下降的特征趨勢，這可能歸因于透明質酸酶對G1/CB[8]@HACD的初步降解導致染料分子從超分子組裝體中釋放，從而廢除了PRET過程，進而恢復了磷光信號。然而，HACD的進一步酶降解解除了對G1/CB[8]的二次限域效應，導致磷光強度隨后下降。與商業NIR染料和最先進的用于NIR生物成像的PRET系統相比，G1/CB[8]@HACD表現出可觀的量子產率、NIR發光的長壽命以及出色的光穩定性，使其成為近紅外延遲熒光成像的有前途的候選者。
考慮到通過PRET構建的三元納米超分子組裝體G1/CB[8]@HACD具有良好的NIR延遲熒光發射特性，并且可以被腫瘤細胞上過表達的HA受體識別，我們探索了其在腫瘤靶向生物成像中的應用。分別用G1/CB[8]@HACD處理人肺癌細胞（A549細胞）和人胚胎腎細胞（293T細胞）12小時，然后與Hoechst和Mito-Tracker Green或Lyso-Tracker Green一起孵育進行定位實驗。通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察G1/CB[8]@HACD在細胞器中的分布。A549細胞顯示出明亮的NIR發射，對應于G1/CB[8]@HACD的延遲熒光，而在正常的293T細胞的NIR通道中幾乎沒有發現信號，這表明G1/CB[8]@HACD通過HA受體介導的內吞作用優先內化到癌細胞中，而不是正常細胞中。此外，NIR發光信號與Mito-Tracker Green的信號重疊良好，相應地計算出的Pearson相關系數為78%，揭示了G1/CB[8]@HACD在癌細胞中進行靶向線粒體成像的能力。此外，通過CCK-8測定試劑盒評估了細胞毒性，結果表明，在孵育24小時后，A549細胞和293T細胞的細胞活力均保持在90%以上，證明了G1/CB[8]@HACD具有優異的生物相容性。受到G1/CB[8]@HACD在細胞水平上出色的線粒體靶向NIR成像能力的鼓舞，進行了體內成像以進一步評估其臨床轉化潛力。動物使用和實驗程序獲得了南開大學動物實驗倫理委員會的批準，所有實驗方案和操作程序均按照相關指南進行。通過尾靜脈注射將G1/CB[8]@HACD（100 μM，0.13 mL）給予荷有A549的BALB/c裸鼠，并在孵育12小時后通過體內成像系統（IVIS）評估其分布。G1/CB[8]@HACD集中在腫瘤組織中，這可能歸因于其合適的尺寸以及其被腫瘤表面豐富的HA受體識別而產生的增強滲透性和滯留效應（EPR）。
3 Conclusion
總之，我們通過CB[8]的大環限域和HACD的二次組裝，成功構建了一種單分子PRET系統，實現了NIR延遲熒光發射，用于靶向細胞成像。PRET系統中供體和受體之間的剛性二芐基連接體允許與CB[8]形成反平行堆積模式，從而形成分子間電荷轉移陣列，實現了G1從納米纖維到納米棒，然后隨著CB[8]和HACD的逐步加入轉變為囊泡的拓撲轉變。同時，三元超分子組裝體G1/CB[8]@HACD獨特的自組裝模式通過多級限域效應促進了從溴苯基吡啶到蒽基吡啶的單分子PRET，將500 nm的磷光發射轉換為650 nm的NIR延遲熒光發射，壽命為11.20 μs。此外，這種多級限域激活的單分子PRET系統顯示出320 nm的大斯托克斯位移，并成功應用于線粒體靶向腫瘤細胞成像，且細胞毒性可忽略不計，這為構建單分子PRET系統提供了便捷的途徑，并對功能化NIR發光材料的發展具有潛力。
