《Molecular Plant Pathology》：The Molecular Cochaperone NbSGT1 May Function as an Endogenous Suppressor of RNA Silencing That Is Recruited by a Potyvirus in Infection of Plants
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本研究揭示了煙草（Nicotiana benthamiana）的分子伴侶SGT1（Suppressor of the G2 allele of Skp1）可作為內源性RNA沉默抑制因子（ESR），并與馬鈴薯Y病毒科（Potyvirus）的夜來香花葉病毒（Telosma mosaic virus， TelMV）的輔助成分-蛋白酶（HC-Pro）通過其SGS結構域直接互作。研究表明，HC-Pro招募NbSGT1，增強了其自身的RNA沉默抑制（RSS）活性，從而促進了TelMV的侵染。NbSGT1還能夠在mRNA和蛋白水平促進外源基因的表達，并下調RNA沉默通路中的關鍵基因（如AGOs、DCLs、RDRs和SGS3）。這些發(fā)現(xiàn)為植物病毒如何利用宿主因子逃逸防御提供了新的機制見解。
1 引言
RNA沉默是真核生物中一種保守的、序列特異性的基因表達調控機制，通過轉錄基因沉默（TGS）和轉錄后基因沉默（PTGS）實現(xiàn)。植物病毒是嚴格的細胞內寄生物，能引發(fā)毀滅性病害。作為防御機制，植物利用RNA沉默靶向降解病毒RNA。經典的植物RNA沉默核心通路包括兩個主要步驟：首先，RNA依賴的RNA聚合酶（RDR）以單鏈RNA前體合成雙鏈RNA（dsRNA），隨后由Dicer-like內切核糖核酸酶（DCLs）將其切割成小干擾RNA（siRNAs）；然后，這些siRNAs被組裝入含有Argonaute（AGO）核酸酶的RNA誘導沉默復合體（RISC）中，以切割同源靶標RNA。為對抗宿主的RNA沉默防御，病毒進化出了稱為病毒RNA沉默抑制子（VSRs或RSSs）的蛋白，其中研究最廣泛的包括黃瓜花葉病毒的2b蛋白、番茄叢矮病毒的p19以及馬鈴薯Y病毒的HC-Pro蛋白。
除了眾多的病毒抑制子，植物中也報道了內源性RNA沉默抑制因子（ESRs），如煙草的鈣調蛋白相關蛋白rgs-CaM。最近的證據表明，包括雙生病毒、馬鈴薯X病毒和馬鈴薯S病毒在內的植物病毒可以利用ESRs來對抗宿主防御。然而，其潛在機制尚未完全闡明。
百香果是一種多年生藤本果樹，病毒病是其生產的主要限制因素。夜來香花葉病毒（TelMV， Potyvirus）是全球范圍內侵染百香果最常見的病毒病原體。作為一種馬鈴薯Y病毒，其編碼的輔助成分-蛋白酶（HC-Pro）是一個多功能蛋白，參與蚜蟲傳播、蛋白酶活性、病毒復制、病毒移動和基因沉默抑制。近期研究表明，TelMV編碼的HC-Pro蛋白具有RSS活性。
抑制因子G2等位基因（SGT1）是一種高度保守的分子伴侶，在植物發(fā)育和免疫反應等多個方面發(fā)揮作用。SGT1已被證實參與了多種植物病毒的感染過程，但SGT1如何調控病毒感染的機制尚不完全清楚。此外，雖然馬鈴薯Y病毒是已知最大的植物RNA病毒類群，但SGT1是否參與馬鈴薯Y病毒的感染仍不明確。
本研究旨在鑒定在TelMV感染背景下與HC-Pro相關的宿主蛋白，并研究HC-Pro的互作蛋白NbSGT1在病毒感染過程中的作用。我們發(fā)現(xiàn)NbSGT1與HC-Pro互作，增強了其RSS活性，并促進了植物中TelMV的感染。NbSGT1還能在蛋白和mRNA水平促進外源基因的表達。此外，NbSGT1作為ESR，在煙草中抑制局部RNA沉默。最后，它下調了RNA沉默通路中關鍵基因的表達。這些數(shù)據共同證明，NbSGT1干擾RNA沉默但促進馬鈴薯Y病毒在植物中的感染。
2 結果
2.1 構建帶有雙鏈Strep標簽HC-Pro的TelMV感染性克隆
本研究利用雙Strep標簽構建了HC-Pro融合病毒克隆pTelMV-GFP/Strep，該克隆能夠在煙草（N. benthamiana）中引發(fā)成功的系統(tǒng)性感染，為后續(xù)的親和純化實驗奠定了基礎。
2.2 鑒定病毒侵染過程中與HC-Pro相關的病毒及宿主蛋白
通過親和純化結合液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）分析，從感染pTelMV-GFP/Strep的植物中鑒定出2種病毒蛋白（HC-Pro和CP）和57種宿主蛋白�；虮倔w（GO）和KEGG通路分析顯示，這些宿主蛋白參與了代謝途徑、碳代謝等多種生物學過程。其中，與植物免疫相關的蛋白如GADPH CysP6、RbCS和SGT1引起了研究者的關注。鑒于SGT1在病毒感染中的重要作用及其在馬鈴薯Y病毒感染中尚未有報道，本研究決定重點探究SGT1在TelMV感染中的潛在作用。
2.3 NbSGT1通過其SGS結構域與HC-Pro互作
酵母雙雜交（Y2H）、雙分子熒光互補（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）實驗證實了NbSGT1與HC-Pro在酵母和植物細胞中存在直接的物理互作。結構域分析顯示，是NbSGT1的SGS（SGT1-specific motif）結構域，而非TPR或CS結構域，負責與HC-Pro的相互作用。
2.4 沉默NbSGT1顯著降低TelMV在植物中的局部和系統(tǒng)性感染
利用煙草脆裂病毒（TRV）介導的病毒誘導基因沉默（VIGS）技術，研究者發(fā)現(xiàn)沉默NbSGT1的煙草植株生長出現(xiàn)異常（分枝增多、葉片卷曲馬賽克）。更重要的是，這些植株在接種TelMV-GFP后，局部葉片的感染病灶數(shù)量顯著減少，系統(tǒng)性葉片中的綠色熒光、病毒RNA和GFP蛋白積累水平均大幅下降，表明NbSGT1的沉默嚴重阻礙了TelMV的局部和系統(tǒng)性感染。
2.5 RNAi誘導的瞬時基因沉默NbSGT1減少局部感染并延遲系統(tǒng)性感染
為進一步驗證，研究使用了內含子發(fā)夾RNA（ihpRNA）介導的RNAi技術進行瞬時基因沉默。實驗同樣顯示，在沉默NbSGT1的葉片中，TelMV-GFP的感染病灶更少，病毒RNA和蛋白積累量更低，并且病毒的系統(tǒng)性感染被延遲。
2.6 瞬時過表達NbSGT1促進TelMV在植物中的感染
相反地，當在煙草葉片中與TelMV-GFP共表達mCherry-NbSGT1時，觀察到了更強的綠色熒光信號，RT-qPCR和蛋白質印跡分析也證實了病毒RNA和GFP蛋白積累量的顯著增加，表明NbSGT1的過表達促進了TelMV的感染。
2.7 HC-Pro的K217、I227和E332可能是其與NbSGT1互作的關鍵殘基
利用基于深度學習的蛋白復合物結構預測工具DMFold，研究者預測了HC-Pro中可能與NbSGT1相互作用的位點。酵母雙雜交實驗證實，將K217、I227或E332突變?yōu)楸彼幔ˋla）會破壞HC-Pro與NbSGT1 SGS結構域之間的互作。
2.8 攜帶K217A、I227A或E332A突變體的病毒感染力降低，但不影響HC-Pro的RSS活性
將上述三個點突變引入TelMV-GFP，獲得突變病毒。感染性實驗表明，與野生型病毒相比，這些突變病毒在煙草中的系統(tǒng)性感染能力顯著減弱，表現(xiàn)為系統(tǒng)性葉片熒光信號弱、病毒RNA和GFP蛋白積累量低。然而，通過GFP沉默抑制實驗發(fā)現(xiàn)，這三個HC-Pro突變體在抑制RNA沉默方面與野生型HC-Pro具有相似的活性，表明突變削弱了病毒侵染力，但并未影響HC-Pro固有的RSS功能。
2.9 NbSGT1增強HC-Pro的RSS活性
經典的GFP沉默抑制實驗顯示，與單獨表達HC-Pro相比，共表達HC-Pro和NbSGT1的葉片斑塊在更長時間內維持了更強的GFP熒光強度。RT-qPCR和蛋白質印跡分析進一步證實，共表達NbSGT1時，GFP的mRNA和蛋白水平均更高，說明NbSGT1能夠增強HC-Pro抑制RNA沉默的能力。
2.10 NbSGT1在mRNA和蛋白水平促進外源基因在植物中的表達
研究發(fā)現(xiàn)，共表達GFP-HC-Pro與mCherry-NbSGT1時，GFP-HC-Pro的熒光信號更強，其蛋白和mRNA水平均顯著上調。有趣的是，即使共表達的是單獨的GFP與mCherry-NbSGT1，GFP的表達也在蛋白和mRNA水平得到促進。相比之下，分子伴侶復合物中的另一成員NbRAR1不能促進GFP表達，而NbHSP90僅能提高GFP蛋白水平，不能提升其mRNA水平。這表明NbSGT1在促進基因表達方面，特別是在mRNA水平上，可能具有獨特的新功能。
2.11 NbSGT1可能作為一種內源性RNA沉默抑制因子
通過農桿菌（Agrobacterium）介導的瞬時表達系統(tǒng)進行RNA沉默抑制實驗。在野生型煙草葉片中，共浸潤表達GFP和Myc-NbSGT1的農桿菌，與陰性對照（空載體）相比，GFP熒光能維持更長時間（至4天）。蛋白質印跡和Northern blot分析證實，共表達NbSGT1的葉片中GFP蛋白和mRNA積累量更高，而GFP特異性的siRNAs積累量更低。這些結果表明NbSGT1在植物中能夠抑制RNA沉默。
2.12 NbSGT1抑制局部而非系統(tǒng)性RNA沉默
在穩(wěn)定表達GFP的煙草16c品系中進行的實驗進一步確認了NbSGT1對局部RNA沉默的抑制能力。然而，在長達26天的系統(tǒng)性沉默監(jiān)測實驗中，大多數(shù)共浸潤GFP和NbSGT1的植株，其上部非浸潤葉片和莖桿最終仍出現(xiàn)了表征系統(tǒng)性沉默的紅色熒光，這與已知能抑制系統(tǒng)性沉默的陽性對照p19和HC-Pro形成鮮明對比。這表明NbSGT1能夠抑制局部RNA沉默，但不能抑制系統(tǒng)性RNA沉默。
2.13 NbSGT1下調RNA沉默通路關鍵組分的表達
通過RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，在TRV介導的NbSGT1沉默植株中，多個RNA沉默通路關鍵基因（如NbAGO2、NbDCL1/2/4、NbRDR1/2/6和NbSGS3）的mRNA表達水平顯著上調。相反，在瞬時過表達NbSGT1的植株中，這些基因的表達水平則顯著下調。這從分子水平上解釋了NbSGT1如何通過負調控RNA沉默核心元件的表達來發(fā)揮其抑制作用。
3 討論
SGT1作為分子伴侶，在植物發(fā)育和免疫中扮演多種角色。本研究提供了證據表明分子伴侶SGT1具有一項新功能，即作為宿主ESR，并被馬鈴薯Y病毒通過HC-Pro互作招募，以實現(xiàn)高效的病毒感染。研究者提出了一個NbSGT1促進馬鈴薯Y病毒感染的模型，強調了HC-Pro-NbSGT1互作在病毒感染中的關鍵作用，以及其內源性抑制RNA沉默的功能。
3.1 NbSGT1與HC-Pro互作
本研究首次報道了TelMV感染中宿主蛋白的候選者，為理解TelMV-宿主互作提供了寶貴信息。NbSGT1通過其SGS結構域與HC-Pro互作，而該結構域也介導了SGT1與其他已知互作蛋白（如HSC70、Cyr1/Cdc35等）的結合。HC-Pro與NbSGT1的共表達顯著提高了HC-Pro的RSS活性，這可能部分歸因于NbSGT1存在時HC-Pro蛋白水平的增加。此外，三個與NbSGT1互作能力受損的HC-Pro突變體病毒表現(xiàn)出感染力的下降，表明這種互作對病毒感染至關重要。HC-Pro-NbSGT1互作的具體模式及其影響病毒感染的詳細分子機制仍需進一步研究。
3.2 NbSGT1是RNA沉默的負調控因子
本研究提供了多方面證據證明NbSGT1可作為植物內源性RNA沉默抑制因子。首先，除了其作為分子伴侶提高蛋白水平的經典作用外，NbSGT1還能提高外源基因的轉錄水平。其次，NbSGT1在農桿菌浸潤實驗中能抑制野生型和16c煙草中的RNA沉默。第三，NbSGT1抑制局部但不抑制系統(tǒng)性RNA沉默。最后，NbSGT1顯著下調RNA沉默通路關鍵組分（AGOs、DCLs、RDRs和SGS3）的表達。然而，NbSGT1抑制RNA沉默的確切機制仍不清楚，有待進一步探究。
近期的研究揭示了經典分子伴侶獨立于其伴侶活性的非經典功能。本研究關于NbSGT1作為ESR的新發(fā)現(xiàn)，以及觀察到植物HSP70（而非HSP90）能在mRNA水平促進基因表達，都表明某些分子伴侶的功能可能超越了傳統(tǒng)的伴侶活性范疇。這項工作為SGT1如何超越其作為分子伴侶的傳統(tǒng)角色來調控蛋白質穩(wěn)態(tài)提供了新視角，也為未來研究SGT1在RNA沉默抑制中的結構功能特性、植物病毒招募SGT1進行高效感染的分子機制，以及SGT1抑制RNA沉默的具體途徑奠定了基礎。
