在開(kāi)花植物的生命循環(huán)中，二倍體的孢子體與單倍體的配子體世代交替。孢子體通過(guò)減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體的配子體。雄配子體（花粉）隨后在雌蕊柱頭上萌發(fā)，花粉管運(yùn)送精細(xì)胞完成雙受精，重建二倍體孢子體。這一過(guò)程的成功高度依賴于花粉的正常發(fā)育與功能。雄性不育（MS）是研究植物生殖發(fā)育的理想模型，并對(duì)雜交育種具有重要價(jià)值。根據(jù)缺陷來(lái)源，MS可分為由孢子體基因型控制的孢子體雄蕊不育（SMS）和由配子體自身基因型決定的配子體雄蕊不育（GAMS）。與SMS相比，GAMS表型細(xì)微，鑒定更具挑戰(zhàn)性。

根據(jù)雄配子體發(fā)育過(guò)程中缺陷發(fā)生的階段，本文將GAMS分為三大類，反映了雄配子體生命周期中的關(guān)鍵功能轉(zhuǎn)換。

PMD涵蓋從四分體釋放出的小孢子到獲得完全成熟期間發(fā)生的失敗。這導(dǎo)致花粉粒通常皺縮、塌陷，無(wú)法積累正常水平的儲(chǔ)存物質(zhì)（如淀粉），從而失去活力。胼胝質(zhì)壁可以圍繞花粉母細(xì)胞形成，但atgsl1/5突變體的小孢子由于缺乏分離四分體的胼胝質(zhì)而異常分離，產(chǎn)生小而皺縮或大而多核的花粉粒。

PMD可由多種細(xì)胞缺陷引起。核異常，包括核丟失或出現(xiàn)額外核，可見(jiàn)于atsec31a/31b、atgpt1、ospcbp和oscap1等突變體。發(fā)育延遲也很常見(jiàn)。例如，osgcd1表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，成熟時(shí)仍為二細(xì)胞花粉。細(xì)胞器缺陷是另一個(gè)標(biāo)志。Osrip1突變體顯示線粒體發(fā)育受損，嵴和細(xì)胞質(zhì)密度降低，而atvha-a突變體則表現(xiàn)為高爾基體形態(tài)異常和囊泡形成減少。

花粉內(nèi)壁的正確形成對(duì)成熟花粉至關(guān)重要，其破壞是PMD的常見(jiàn)原因。一些突變體，如osrip1、oscap1、osgt1和osminr528，表現(xiàn)出更薄或缺失的內(nèi)壁。相反，AtCESA1、AtCESA3、AtCESA2/6/9、AtHYC1、AtNPG1/R1/R2、AtPI4Kα1和AtEFOP3/4等基因的突變會(huì)導(dǎo)致內(nèi)壁異常增厚。上述所有缺陷都阻止花粉達(dá)到功能成熟狀態(tài)，因此被歸類為PMD。

PGD突變體產(chǎn)生的花粉在形態(tài)上看似成熟，但無(wú)法萌發(fā)，或在體外或柱頭上表現(xiàn)出萌發(fā)缺陷。此類包括花粉完全無(wú)法萌發(fā)的突變體，如在AtSUC1、OsSUT1、AtPTF2、OsPTF2、AtNPG1、AtSEC3A、OsSPS1和OsMLO12等基因突變后觀察到。

另一種PGD表型涉及花粉管在萌發(fā)啟動(dòng)后不久破裂，這是由于細(xì)胞壁完整性或滲透調(diào)節(jié)缺陷所致。這是atsks11/12、atsks13、atgdpdl6/7、osgdpdl5、attms1、atvgd1、osptd1和osrupo等突變體的特征。

第三類PGD包括花粉管能夠起始生長(zhǎng)但表現(xiàn)出嚴(yán)重的伸長(zhǎng)缺陷，顯得短、腫脹、彎曲或盤繞。這表明維持頂端極性生長(zhǎng)失敗，見(jiàn)于atsks11/12、atsks13、atren4、osImpβ1、osap65、osgori、osrac6和zmcoi2a/2b等突變體。所有影響萌發(fā)啟動(dòng)、穩(wěn)定性或極性生長(zhǎng)的缺陷表型均被歸類為PGD。

MFCD突變體產(chǎn)生的花粉能夠完成成熟，并且通常可以在體外萌發(fā)，但在與雌性生殖組織（雌蕊）互作的特定階段失敗，導(dǎo)致受精失敗。缺陷可能發(fā)生在初始的花粉-柱頭界面。例如，atspik和atkinβγ突變體花粉在柱頭上水合不良，盡管在體外表型正常，但仍無(wú)法萌發(fā)。

其他突變體，如atgcd1、atvps41和atvgd1，在柱頭上萌發(fā)正常，但穿透柱頭表面或進(jìn)入花柱引導(dǎo)組織的能力受損。

第三組突變體，包括atvgd1和zmpme10，在花柱內(nèi)表現(xiàn)出正常的花粉管生長(zhǎng)，但未能到達(dá)胚珠。此外，花粉管可能到達(dá)胚珠附近，但未能被準(zhǔn)確引導(dǎo)至胚珠，如atcngc18-1和atmlo5/9/15突變體所見(jiàn)。即使成功引導(dǎo)至胚珠，由于花粉管接收缺陷，受精也可能失敗，此時(shí)花粉管停止生長(zhǎng)、破裂并釋放精細(xì)胞。atbups1/2的突變體在這一關(guān)鍵的最后步驟存在缺陷。所有這些發(fā)生在雌雄互作過(guò)程中的缺陷被歸類為MFCD。

上述表型分類突出了易受遺傳破壞的關(guān)鍵發(fā)育轉(zhuǎn)換。為了理解這些缺陷如何產(chǎn)生，本文進(jìn)一步深入研究了GAMS基因的分子功能，根據(jù)它們調(diào)控的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行組織：花粉成熟、萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)和接收。

花粉成熟是指單倍體小孢子轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)完整、儲(chǔ)備充足、休眠且可育的配子體，具備萌發(fā)所需的儲(chǔ)備。這一過(guò)程需要：1）構(gòu)建堅(jiān)固且特化的花粉壁，2）建立內(nèi)部細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，以及3）保持細(xì)胞核和遺傳物質(zhì)的完整性。GAMS基因?qū)λ�有方面都至關(guān)重要。

花粉壁由外壁和內(nèi)壁組成，對(duì)保護(hù)和萌發(fā)至關(guān)重要。外壁具有萌發(fā)孔，是大多數(shù)開(kāi)花植物花粉管萌發(fā)的預(yù)定位置。外囊泡復(fù)合體亞基SEC3A通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞壁物質(zhì)（如果膠和纖維素）向質(zhì)膜的極性分泌，參與定義這些位置。

內(nèi)壁主要由纖維素和果膠組成。它提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，對(duì)花粉管萌發(fā)至關(guān)重要。纖維素合酶AtCESA1、AtCESA3、AtCESA2、AtCESA6和AtCESA9在質(zhì)膜上形成復(fù)合物以合成纖維素。信號(hào)模塊PI4Kα1-NPGs-HYC1-EFOP3/4影響質(zhì)膜上的內(nèi)壁果膠含量。同時(shí)，鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白NPG1被Ca²⁺激活，并通過(guò)結(jié)合果膠甲酯酶PLLs來(lái)調(diào)節(jié)果膠特性。類似地，果膠甲酯酶AtVGD1也調(diào)節(jié)內(nèi)壁果膠成分。在水稻中，OsmiR528負(fù)調(diào)控OsUCL23的表達(dá)，后者可能通過(guò)與前液泡區(qū)室（PVCs）中的OsPOT相互作用影響類黃酮和其他代謝物的運(yùn)輸，從而影響內(nèi)壁沉積。此外，L-阿拉伯糖激酶OsCAP1和糖基轉(zhuǎn)移酶OsGT1等糖代謝酶對(duì)正確的細(xì)胞壁形成也至關(guān)重要。

細(xì)胞穩(wěn)態(tài)包括內(nèi)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性、高效的代謝物運(yùn)輸和能量平衡，所有這些對(duì)花粉的成熟和隨后的萌發(fā)都至關(guān)重要。液泡H⁺-ATP酶亞基A（AtVHA-A）酸化內(nèi)膜系統(tǒng)，這對(duì)維持高爾基體完整性和整體膜系統(tǒng)功能至關(guān)重要。

蛋白質(zhì)運(yùn)輸由囊泡組分促進(jìn)，包括SEC31A和SEC31B，它們是COPII囊泡被膜蛋白，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）到高爾基體的運(yùn)輸。能量和碳代謝的基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶，例如葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtGPT1，它負(fù)責(zé)將葡萄糖-6-磷酸（Glc6P）從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到非綠色質(zhì)體，為淀粉合成、脂肪酸生物合成和氧化戊糖磷酸途徑（OPPP）提供底物，確保物質(zhì)運(yùn)輸和能量平衡。鈣信號(hào)相關(guān)蛋白OsPCBP調(diào)節(jié)淀粉積累。此外，通過(guò)OsSUT1等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輸入的蔗糖及其由OsSPS1等酶的合成，確保有足夠的能量?jī)?chǔ)備用于花粉萌發(fā)。

作為父本遺傳信息的載體，花粉細(xì)胞核的完整性和基因表達(dá)的保真性至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄因子PTF2和OsPTF2參與RNA聚合酶II（RNAP II）準(zhǔn)確招募到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，確保正確的基因表達(dá)。OsRIP1也通過(guò)形成WD40蛋白復(fù)合物來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。

OsImpβ1介導(dǎo)貨物蛋白（Cargo-P）進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，Ran-GTP與OsImpβ1結(jié)合，迫使OsImpβ1釋放Cargo-P。空的OsImpβ1隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞質(zhì)，啟動(dòng)新一輪的運(yùn)輸。

花粉萌發(fā)定義為花粉粒在柱頭上水合后，在特定位置出現(xiàn)花粉管。這需要精確準(zhǔn)備萌發(fā)位點(diǎn)、成功的花粉-柱頭互作以及充足的能量和滲透支持。

如前面所述，外囊泡組分AtSEC3A通過(guò)在花粉成熟后期指導(dǎo)細(xì)胞壁物質(zhì)的極性分泌，在定義花粉管出現(xiàn)位點(diǎn)方面起著關(guān)鍵作用。

花粉粒在柱頭上的成功水合對(duì)其萌發(fā)至關(guān)重要。花粉水合受OsMLO12調(diào)節(jié)，可能通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)中的鈣調(diào)蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)。液泡蛋白分選因子AtVPS41參與膜運(yùn)輸，對(duì)花粉管與柱頭表面的成功互作至關(guān)重要。

萌發(fā)需要能量和滲透驅(qū)動(dòng)力。SnRK1復(fù)合體亞基KINβγ維持花粉中的ROS水平，進(jìn)而影響鉀通道蛋白SPIK的表達(dá)，從而介導(dǎo)K⁺吸收和花粉的滲透調(diào)節(jié)。蔗糖既是能量來(lái)源也是滲透劑。它通過(guò)OsSUT1等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輸入花粉，也可以由OsSPS1等酶內(nèi)部合成。

花粉管生長(zhǎng)涉及快速的極性伸長(zhǎng)和向胚珠的精確導(dǎo)向。這需要大量靶向運(yùn)輸細(xì)胞壁和膜材料、充足的能量以及緊密調(diào)控內(nèi)部尖端環(huán)境（如離子梯度）以維持生長(zhǎng)。

花粉管壁的完整性和可塑性受到動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。天冬氨酸蛋白酶OsAP65在PVCs中水解特定底物，為花粉管伸長(zhǎng)提供必需物質(zhì)。抗壞血酸氧化酶（AAO）家族成員（如AtSKS11、AtSKS12和AtSKS13）及其水稻同源物OsPTD1調(diào)節(jié)各種細(xì)胞壁多糖的沉積和重塑。AtSKS13還將茉莉酸信號(hào)與花粉管生長(zhǎng)停止的調(diào)控聯(lián)系起來(lái)。甘油磷酸二酯磷酸二酯酶樣蛋白AtGDPDL6/7影響纖維素合酶AtCSLD1和AtCSLD4的定位，從而影響纖維素沉積。果膠甲酯酶AtVGD1和ZmPME10微調(diào)果膠的甲酯化，通過(guò)影響鈣交聯(lián)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁剛度，從而平衡花粉管頂端生長(zhǎng)所需的剛性和可塑性。

極性生長(zhǎng)依賴于靶向囊泡運(yùn)輸。在水稻中，支架蛋白OsGORI與內(nèi)吞相關(guān)蛋白ANTH和GTP酶Rac6相互作用，形成內(nèi)吞/外吞復(fù)合物，協(xié)調(diào)囊泡循環(huán)。OsGORI-ANTH復(fù)合物還促進(jìn)Rac6的激活（從GDP到GTP）。REN4與活性ROP1相互作用并拮抗之，微調(diào)ROP1活性梯度及其與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）的協(xié)調(diào)，這對(duì)穩(wěn)定的極性生長(zhǎng)和導(dǎo)向至關(guān)重要。

穩(wěn)定的生長(zhǎng)和導(dǎo)向需要能量、信號(hào)傳導(dǎo)和脅迫耐受性。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtSUC1輸入蔗糖，為花粉管生長(zhǎng)提供持續(xù)能量。ZmCOI2a和ZmCOI2b調(diào)節(jié)茉莉酸信號(hào)，影響花粉管生長(zhǎng)，并可能充當(dāng)停止信號(hào)。OsGCD1通過(guò)影響能量代謝和ROS信號(hào)來(lái)影響線粒體功能。離子穩(wěn)態(tài)也很關(guān)鍵。植物特有的CrRLK1L受體激酶亞家族成員RUPO通過(guò)磷酸化依賴性相互作用負(fù)調(diào)控K⁺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsHAK1/19/20，從而維持花粉管中的K⁺穩(wěn)態(tài)。環(huán)核苷酸門控通道CNGC18在花粉管尖端介導(dǎo)Ca²⁺流入，維持生長(zhǎng)和導(dǎo)向所必需的Ca²⁺梯度。MLO蛋白（MLO5/9/15）通過(guò)SNARE復(fù)合物（VAMP721/722）響應(yīng)雌性信號(hào)將CNGC18招募到質(zhì)膜，將導(dǎo)向線索與Ca²⁺內(nèi)流聯(lián)系起來(lái)。此外，熱激蛋白TMS1通過(guò)確保高溫脅迫下正確的蛋白質(zhì)折疊來(lái)賦予耐熱性，因?yàn)?em>tms1在30°C時(shí)表現(xiàn)出花粉管生長(zhǎng)抑制和破裂，而在18°C時(shí)花粉管生長(zhǎng)正常。

花粉管接收是最后的關(guān)鍵步驟，此時(shí)花粉管到達(dá)胚囊，停止生長(zhǎng)并破裂，釋放兩個(gè)精細(xì)胞進(jìn)行受精。其成功直接決定植物生殖成功和種子產(chǎn)量。

在擬南芥中，由ANX1/2和BUPS1/2形成的受體樣激酶復(fù)合物感知花粉管衍生肽RALF4和RALF19。這觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中BUPS激酶招募RopGEF1和RopGEF12，然后激活小GTP酶ROP1、ROP3、ROP5和ROP9。這些ROPs通過(guò)控制包括內(nèi)吞作用在內(nèi)的關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程，作為頂端生長(zhǎng)的核心調(diào)控因子，從而控制極性生長(zhǎng)、破裂和成功的花粉管接收。

基于對(duì)GAMS分子機(jī)制的系統(tǒng)剖析，將這些知識(shí)轉(zhuǎn)化為玉米等主要作物的遺傳改良至關(guān)重要。作為一種表現(xiàn)出強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)的主糧作物，玉米GAMS基因的鑒定對(duì)推進(jìn)基于雄性不育的雜交育種至關(guān)重要。盡管作物間存在相當(dāng)大的形態(tài)和基因組多樣性，但有性生殖的核心過(guò)程，特別是雄配子體發(fā)育，在被子植物中高度保守。這種發(fā)育保守性表明進(jìn)化同源物通常在生殖生物學(xué)中保留相似功能。

利用這種進(jìn)化保守性，本文采用比較基因組學(xué)方法鑒定玉米中的候選GAMS基因。使用擬南芥（37個(gè)基因）和水稻（16個(gè)基因）的已知GAMS基因作為查詢，在玉米基因組中鑒定出51個(gè)推定的同源基因。其中，18個(gè)是擬南芥和水稻GAMS基因的相互同源物，例如AtSUC1和OsSUT1以及AtPFT2和OsPTF2，其中任一同源物的突變都會(huì)在擬南芥和水稻中導(dǎo)致類似的PGD表型。因此，這些基因極有可能在調(diào)控雄配子體發(fā)育中發(fā)揮保守作用。通過(guò)整合擬南芥、水稻和玉米的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本文鑒定了六個(gè)高可靠性的候選GAMS基因，ZmPTF2、ZmGDPDL1、ZmGCD1、ZmMLO1/ ZmMLO2和ZmPME10，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨ǚ郯l(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出與其擬南芥和水稻同源物相似的表達(dá)譜。值得注意的是，其中一個(gè)預(yù)測(cè)基因已被功能驗(yàn)證：ZmPME10（GAMS，MFCD型）。

除了上述在擬南芥和水稻中都有同源物的推定玉米GAMS基因外，本文還根據(jù)序列同源性鑒定了其他23個(gè)擬南芥GAMS基因的玉米同源物，其中八個(gè)基于表達(dá)模式分析是高可靠性候選基因（ZmCESA6、ZmHYC1、ZmPI4Kα1、ZmSPIK1/2/3、ZmVPS41和ZmCNGC18）。同樣，鑒定了10個(gè)與其他水稻GAMS基因同源的玉米同源基因，并假設(shè)四個(gè)高可靠性候選基因（ZmCAP1、ZmGT1、ZmSPS2和ZmRac6），因?yàn)樗鼈冊(cè)诨ǚ郯l(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出與其水稻同源物相似的表達(dá)譜。隨后，本文選擇了顯示花粉特異性表達(dá)的ZmCESA6來(lái)驗(yàn)證生物信息學(xué)策略的可靠性。通過(guò)基因編輯產(chǎn)生了功能喪失的ZmCESA6突變體系，導(dǎo)致配子體雄性不育。正反交確認(rèn)ZmCESA6突變導(dǎo)致雄性配子體傳遞缺陷。碘-碘化鉀染色顯示ZmCESA6+/–花粉與野生型（WT）花粉無(wú)顯著差異。然而，體外萌發(fā)試驗(yàn)顯示，大約一半的ZmCESA6+/–花粉粒萌發(fā)正常，而另一半在體外表現(xiàn)出異常萌發(fā)。這些結(jié)果表明ZmCESA6是玉米雄性配子體育性所需的PGD型GAMS基因，驗(yàn)證了GAMS鑒定方法的有效性和可行性，并表明鑒定出的推定玉米GAMS基因可能發(fā)揮與已知擬南芥和水稻GAMS基因相似的保守作用。