《Scientia Horticulturae》：Mechanisms of sDNA-induced postharvest peach resistance to
Rhizopus stolonifer via
PpMYC2 in the JA signaling
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為解決化學殺菌劑使用引發的病原菌抗性及食品安全風險，研究團隊以根霉病為靶點，探究了外源sDNA作為一種新型DAMP分子，通過JA信號通路及其核心轉錄因子PpMYC2，誘導采后桃果產生系統性抗性(ISR)的機制。結果表明，sDNA能激活MAPK級聯反應，促進JA生物合成及JA應答基因表達，且PpMYC2直接結合下游基因啟動子G-box元件以激活其轉錄。更為重要的是，PpMYC2通過與SAR關鍵調控子PpNPR1互作，拮抗SA信號，從而確立JA信號在抗壞死性真菌中的主導地位，為采后果實病害的綠色防控提供了新策略。
桃果以其香甜多汁而備受喜愛，然而，它們在采收后卻異常脆弱，尤其容易受到多種真菌的侵襲。其中，由根霉引起的軟腐病尤為猖獗，這種壞死性真菌生長迅速，破壞力極強，常給果農和供應鏈帶來巨大的經濟損失。長期以來，化學殺菌劑是控制此類病害的主要手段，但長期使用不僅可能導致病原菌產生抗藥性，更引發了公眾對食品安全和環境污染的深切擔憂。因此，尋找安全、環保且持久的替代性防治策略，已成為采后保鮮領域的迫切需求。
植物自身并非對病原體“坐以待斃”，它們擁有一套精密的先天免疫系統。當植物細胞受到損傷或病原體攻擊時，一些被稱為“損傷相關分子模式”（DAMPs）的自身分子會釋放到細胞外，像“警報”一樣激活植物的免疫反應。近年來，由植物自身基因組DNA片段化形成的“胞外自身DNA”（sDNA）作為一種新型DAMP，引起了研究人員的濃厚興趣。此前有研究表明，sDNA能引發植物的早期免疫反應，如活性氧（ROS）爆發和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯激活。然而，sDNA如何在采后水果中，特別是在應對根霉這類壞死性真菌時，協調下游的激素信號通路，其具體的分子調控“劇本”仍不甚清晰。
茉莉酸（JA）是植物抵御壞死性真菌和害蟲攻擊的核心防御激素。其信號通路中的關鍵“導演”，是一個名為MYC2的轉錄因子。在缺乏JA時，JAZ蛋白會像“鎖”一樣束縛住MYC2，使其無法“開工”。而當JA水平升高時，會觸發JAZ蛋白的降解，“釋放”MYC2，使其進入細胞核，啟動一系列JA應答防御基因的表達，從而建立起誘導系統抗性（ISR）。與此同時，植物體內還存在一條由水楊酸（SA）介導的系統獲得抗性（SAR）通路，通常用于對抗活體或半活體營養型病原體。這兩條通路并非總是“和睦相處”，它們之間存在著復雜的“對話”（crosstalk），而一個名為NPR1的蛋白被認為是協調SA與JA信號“對話”的關鍵“調解員”。那么，sDNA觸發的免疫警報，是如何通過JA信號通路，特別是通過MYC2這個“導演”，來指揮桃果抵抗根霉入侵的？JA信號與SA信號在這場防御戰中又是如何互動的？這正是本研究試圖解答的核心問題。
為了解決這些問題，研究人員在《Scientia Horticulturae》上發表了一項系統性研究。他們以‘皮球’桃果實為材料，構建了病原菌（根霉）接種、sDNA處理、sDNA預處理后接種等實驗組。研究利用了多項分子生物學關鍵技術：通過酵母雙雜交（Y2H）和熒光素酶互補成像（LCI）技術驗證蛋白互作；通過酵母三雜交（Y3H）分析多元蛋白復合體的形成；采用電泳遷移率變動分析（EMSA）和雙熒光素酶報告基因（DLR）檢測轉錄因子的DNA結合能力與轉錄激活活性；并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術和過表達技術，在桃果實中構建了PpMYC2基因的敲除突變體和過表達株系，以在活體水平驗證其功能。
3.1. sDNA激活桃果實的早期防御相關反應
研究首先證實，sDNA處理能顯著抑制根霉引起的桃果軟腐病。進一步分析發現，sDNA誘導了過氧化氫（H2O2）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的積累，并上調了MAPK級聯通路中多個基因（如PpMAPKKK1/3/5， PpMAPKK2/3/5， PpMAPK1/2/7）的表達。這表明sDNA作為一種DAMP，成功激活了桃果的早期模式觸發免疫（PTI）反應，為后續的激素信號傳遞奠定了基礎。
3.2. PpMAPK1與PpLOX2的互作提升了桃果中JA的生物合成及JA應答基因的轉錄
研究人員通過Y2H和LCI實驗，首次證實了MAPK通路中的PpMAPK1蛋白與JA生物合成關鍵酶PpLOX2之間存在直接的物理互作。這暗示MAPK信號可能通過調控LOX2的功能來影響JA合成。實驗數據支持了這一推測：sDNA處理顯著提高了桃果中JA及其活性形式JA-Ile的含量，并強烈上調了JA生物合成通路基因（PpLOX2， PpAOS1， PpAOC1， PpOPR2， PpACX1， PpJAR1）以及典型的JA應答基因（PpPDF1.2， PpVSP2， PpTHI2.1）的轉錄水平。
3.3. PpMYC2的轉錄及分子特性分析
作為JA信號的核心轉錄因子，PpMYC2的轉錄本在sDNA處理和根霉接種后迅速升高。系統發育和序列比對分析顯示，PpMYC2與其他物種的MYC2蛋白同源性很高，且其序列中包含核定位信號（NLS）。亞細胞定位實驗證實，PpMYC2是一個定位于細胞核的蛋白，這與其作為轉錄因子的功能相符。
3.4. PpNPR1與PpMYC2結合并抑制其與PpTGA1的互作
為了探索JA與SA信號的交叉對話，研究通過Y3H實驗分析了PpMYC2、PpNPR1（SA信號的關鍵調控子）和PpTGA1（NPR1在SA通路中的互作蛋白）三者之間的關系。結果發現，當PpMYC2存在時，它會競爭性地與PpNPR1結合，從而干擾了PpNPR1與PpTGA1之間復合體的形成。這表明在JA信號激活時，PpMYC2可能通過“占用”PpNPR1，來抑制SA信號通路的活性。
3.5. PpMYC2激活JA應答基因的轉錄活性
EMSA實驗證明，純化的PpMYC2蛋白能夠直接結合到下游JA應答基因（PpPDF1.2， PpVSP2， PpTHI2.1）啟動子區的G-box（5‘-CACGTG-3’）順式元件上。DLR實驗進一步顯示，PpMYC2能顯著激活這些報告基因的表達，而共表達PpNPR1則會抑制PpMYC2的這種激活作用。這從分子水平證實了PpMYC2是JA應答基因的直接正調控因子，而PpNPR1則扮演了轉錄抑制子的角色。
3.6. 過表達PpMYC2上調JA應答基因的轉錄
為了在果實整體水平驗證PpMYC2的功能，研究人員構建了PpMYC2過表達的轉基因桃。與野生型相比，過表達株系對根霉感染的抵抗力顯著增強，病斑直徑和真菌生物量減小，活性氧積累更少。同時，這些株系中JA含量、JA生物合成基因及JA應答基因的表達水平均顯著高于野生型，且sDNA處理能進一步放大這種效應。
3.7. 敲除PpMYC2降低了對根霉的病害反應
相反，利用CRISPR/Cas9技術敲除PpMYC2的桃突變體，則表現出對根霉感染的更高敏感性。突變體中病害更嚴重，活性氧爆發更劇烈，且JA生物合成與JA應答基因的表達水平均顯著降低。這反過來證明了PpMYC2對于桃果通過JA途徑建立抗病性是不可或缺的。
綜合以上結果，本研究得出明確結論：sDNA作為一種有效的DAMP激發子，能夠激活桃果的早期PTI反應（包括H2O2積累和MAPK級聯激活）。更重要的是，它通過促進PpMAPK1與PpLOX2的互作，增強了JA的生物合成，并上調了JA信號通路的核心轉錄因子PpMYC2的表達。PpMYC2進入細胞核后，直接結合并激活下游JA應答防御基因的轉錄，從而建立起有效的ISR以抵抗根霉。研究還揭示了sDNA誘導的抗性中JA與SA信號對話的新機制：活化的PpMYC2會與SA信號的核心調控子PpNPR1結合，這種互作不僅可能抑制了PpMYC2對下游基因的完全激活（如DLR實驗所示），更競爭性地破壞了PpNPR1與PpTGA1的結合，從而在信號通路的“十字路口”抑制了SA介導的SAR途徑，確保了JA信號在抗壞死性真菌中的主導地位。
這項研究的意義深遠。它首次在采后桃果中系統地解析了sDNA通過JA信號通路誘導抗性的分子框架，并明確了PpMYC2在其中承上啟下的核心調控作用。所揭示的PpMYC2-PpNPR1互作機制，為理解果實中JA與SA信號的拮抗對話提供了新的分子視角。在應用層面，該研究證實了sDNA作為一種天然、安全的生物激發子，在采后病害綠色防控中的巨大潛力，為開發基于植物自身免疫激活的新型保鮮技術奠定了堅實的理論基礎。
