摘要

堿性磷酸酶（ALP）活性是診斷牲畜疾病、進行營養管理和評估牛奶巴氏殺菌效果的重要生物標志物，對食品安全和食品科學具有重要意義。在這項研究中，我們開發了一種基于ATP水解與CRISPR/Cas12a系統結合的新方法來檢測食品樣本中的ALP活性。該檢測方法使用了一種DNA分子識別鎖探針，該探針包含一個特異性識別ATP的適配體和一條激活鏈，用于觸發CRISPR/Cas12a的切割活性。在沒有ALP的情況下，ATP作為底物參與水解反應，從而打開鎖結構并釋放激活鏈，進而激活Cas12a蛋白，產生熒光信號。相反，當目標ALP存在時，它會通過去磷酸化反應催化ATP的水解，阻止“適配體-激活體”分子鎖的打開，從而抑制Cas12a的激活，導致熒光強度相應降低。在優化條件下，該方法的檢測限為2.52 mU/mL，線性檢測范圍為0–18.75 mU/mL，總檢測時間為70分鐘。該方法成功應用于檢測多種牲畜（雞、豬、羊、牛）樣本及牛奶中的ALP活性，回收率在92%至99%之間。總之，我們開發了一種靈敏度高、成本低廉且檢測速度快的ALP檢測方法，為食品安全監測中的即時檢測（POCT）設備開發提供了有前景的策略。

圖形摘要

堿性磷酸酶（ALP）活性是診斷牲畜疾病、進行營養管理和評估牛奶巴氏殺菌效果的重要生物標志物，對食品安全和食品科學具有重要意義。在這項研究中，我們開發了一種基于ATP水解與CRISPR/Cas12a系統結合的新方法來檢測食品樣本中的ALP活性。該檢測方法使用了一種DNA分子識別鎖探針，該探針包含一個特異性識別ATP的適配體和一條激活鏈，用于觸發CRISPR/Cas12a的切割活性。在沒有ALP的情況下，ATP作為底物參與水解反應，從而打開鎖結構并釋放激活鏈，進而激活Cas12a蛋白，產生熒光信號。相反，當目標ALP存在時，它會通過去磷酸化反應催化ATP的水解，阻止“適配體-激活體”分子鎖的打開，從而抑制Cas12a的激活，導致熒光強度相應降低。在優化條件下，該方法的檢測限為2.52 mU/mL，線性檢測范圍為0–18.75 mU/mL，總檢測時間為70分鐘。該方法成功應用于檢測多種牲畜（雞、豬、羊、牛）樣本及牛奶中的ALP活性，回收率在92%至99%之間。總之，我們開發了一種靈敏度高、成本低廉且檢測速度快的ALP檢測方法，為食品安全監測中的即時檢測（POCT）設備開發提供了有前景的策略。

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