CRISPR系統(tǒng)作為細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，現(xiàn)已成為廣泛使用的基因組編輯工具。其核心由Cas核酸酶蛋白和單鏈引導(dǎo)RNA（sgRNA）組成。Prime Editing是一種基于CRISPR的精確基因編輯策略，它使用由切口酶SpCas9（nSpCas9）和莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV-RT）組成的嵌合蛋白（稱為PE1或改進(jìn)后的PE2）。該系統(tǒng)由一種擴(kuò)展形式的sgRNA，即prime editing guide RNA（PegRNA）引導(dǎo)，該RNA攜帶了要應(yīng)用到靶序列的預(yù)期編輯。

Prime Editing具有多重優(yōu)勢：它不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB），降低了產(chǎn)生非預(yù)期插入/缺失（indel）的風(fēng)險；編輯范圍廣，可校正幾乎所有類型的點突變、插入和缺失；且在不分裂細(xì)胞中同樣有效。然而，其編輯效率相對較低，插入/缺失大小有限，且編輯結(jié)果并非總是完全精確。

為克服低效率問題，研究者開發(fā)了多種策略。PE3策略使用第二個sgRNA在對側(cè)鏈上引入額外的切口，以利于錯配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)將編輯后的鏈選作模板，可將效率提升高達(dá)4.2倍，但可能增加indel和脫靶風(fēng)險。PE4和PE5策略則通過使用顯性失活MLH1（MLH1^dn）暫時抑制MMR系統(tǒng)活性，并結(jié)合第二個切口引導(dǎo)RNA（ngRNA），平均可將編輯效果提升2倍。最近，一種AI生成的MLH1小結(jié)合蛋白（MLH1-SB）被證明抑制效果更佳。此外，Cas9-DNA結(jié)合觸發(fā)的P53依賴性細(xì)胞周期阻滯也會負(fù)面影響編輯效率，共表達(dá)小鼠顯性負(fù)性P53（mP53DD）可在大約2倍程度上提升效率，但存在致癌風(fēng)險。

另一種策略PEn使用具有核酸酶活性的野生型Cas9與PegRNA結(jié)合，本質(zhì)上是prime editing與同源重組（HR）的結(jié)合，可實現(xiàn)高效率編輯，但會產(chǎn)生高頻率的非預(yù)期靶向indel。使用NHEJ抑制劑如i53可部分緩解此問題。

除了基于nSpCas9的PE，其他Cas蛋白也被用于擴(kuò)展PAM識別范圍。例如，使用LbCas12a切口酶（nCas12a）的CPE（circular prime editing）系統(tǒng)，采用分裂的pegRNA和環(huán)狀PBS-RTT RNA模板，可用于多重基因編輯。nSaCas9及其變體（如SaCas9 KKH）也被用于構(gòu)建PE，以識別不同的PAM序列（如NNNGRRT或NNNRRT），盡管其效率通常低于基于nSpCas9的PE。

通過理性設(shè)計和定向進(jìn)化，研究者開發(fā)了多種增強(qiáng)型PE蛋白變體。PEmax是首個工程化的PE2變體，包含人源密碼子優(yōu)化的RT、優(yōu)化的核定位信號以及nSpCas9中的兩個點突變（R221K和N394K），其效率比PE2高約2.8倍。針對非分裂細(xì)胞中dNTP濃度低的問題，研究者設(shè)計了MMLV-RT的YMDD突變（PEmax**，含L435K和V223M突變）以增加對dNTP的親和力及蛋白溶解性。抑制dNTP調(diào)節(jié)蛋白SAMHD1（如使用HIV-2的VPX蛋白）也能提升非分裂細(xì)胞中的編輯效率。

定向進(jìn)化方法，如噬菌體輔助進(jìn)化，產(chǎn)生了PE6變體系列（PE6a-d），它們使用進(jìn)化或工程化-進(jìn)化后的非MMLV來源RT（如evo-Ec48、eng-evo-Tf1、eng-evo-MMLV-RT）。這些變體在不同場景下各具優(yōu)勢：PE6a尺寸最小；PE6b適合短且非結(jié)構(gòu)化的RTT；PE6c和PE6d則更適合長而結(jié)構(gòu)化的RTT或成對pegRNA策略。酵母定向進(jìn)化系統(tǒng)OrthoRep則產(chǎn)生了PE-Y18變體，其在體內(nèi)外均顯示出超越PEmax的活性。

其他增強(qiáng)方法包括：在PE中融合Rad51單鏈DNA結(jié)合域（ssDBD）以穩(wěn)定DNA-RNA雜交體（hyPE2）；融合篩選出的肽段（如IN-PE2）以增強(qiáng)Cas9與核酸的相互作用；在PE C端連接截短的La蛋白以保護(hù)pegRNA的3’末端免受核酸外切酶降解（PE7）。

染色質(zhì)可及性是影響CRISPR/Cas9編輯效率的關(guān)鍵因素。通過將轉(zhuǎn)錄因子（如P65，通過Suntag系統(tǒng)引導(dǎo)）或染色質(zhì)調(diào)控肽段（如HN1和H1G，構(gòu)成CMP-PE-V1）募集至靶位點，可以松散染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而提升PE對DNA的訪問效率，進(jìn)而提高編輯效率。

細(xì)胞內(nèi)的3’核酸外切酶會降解pegRNA，降低其完整性。工程化pegRNA（epegRNA）通過在pegRNA的3’端添加tevopreQ1或mpknot等RNA基序來保護(hù)PBS和RTT序列，可將編輯效率提升3-4倍。其他保護(hù)性結(jié)構(gòu)還包括Zika病毒外切核糖核酸酶抗性基序（Xr-PegRNA）和G-四鏈體結(jié)構(gòu)（G-PE）。

pegRNA的潛在環(huán)化也會影響效率。ePE和tPE（tethered PE）方法通過不同機(jī)制（如添加Csy4可切割位點或?qū)�pegRNA與PE-MCP雜交蛋白拴系）來抑制環(huán)化。分裂PE（sPE）則使用分裂的pegRNA組件（sgRNA和環(huán)狀petRNA），其中環(huán)狀petRNA表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。此外，使用RNA聚合酶II啟動子（p2PE3系統(tǒng)）替代RNA聚合酶III可以避免轉(zhuǎn)錄終止問題，尤其在編輯富含T的靶序列時表現(xiàn)出優(yōu)勢。

PegRNA設(shè)計直接影響編輯效率。關(guān)鍵因素包括：PBS和RTT的長度與GC含量、間隔寡核苷酸（spacer）的特性（如DeepSpCas9評分）、pegRNA的二級結(jié)構(gòu)（避免間隔區(qū)與PBS雜交）等。通常，對于點突變，C-to-T轉(zhuǎn)換效率最高，而T-to-G顛換效率最低。通過引入破壞PAM的同義突變或同義有義突變（spegRNA），可以混淆MMR系統(tǒng)并提高靶向編輯效率。有多種在線工具（如PrimeDesign、PE-designer、DeepPrime等）可用于設(shè)計高效、特異的pegRNA。

傳統(tǒng)的單pegRNA編輯對大片段操作效率低下。成對pegRNA策略應(yīng)運而生，它們使用具有互補RTT序列的兩個pegRNA。Twin-PE是首個此類方法，可實現(xiàn)長達(dá)約100 bp的插入和小于1 kb的刪除。其他方法如Bi-PE、PRIME-Del、GRAND、PEDAR等在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，例如添加同源臂（HA）或使用野生型Cas9核酸酶以提高效率或處理更大片段。TJ-PE（template-jumping prime editing）則使用一種特殊的單pegRNA（含兩個PBS）和一個ngRNA來模擬非LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入機(jī)制。對于三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展疾病的校正，PE-CORE策略利用成對pegRNA機(jī)制，在替換重復(fù)序列為同義密碼子時效果最佳。對于超大片段插入，可將PE與Bxb1絲氨酸整合酶系統(tǒng)結(jié)合（如PASTE策略），實現(xiàn)大片段DNA的定點整合。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率是影響最終編輯結(jié)果的重要因素。使用包含所有編輯組件的單一質(zhì)粒（all-in-one）可比多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染提升數(shù)倍效率。對于體內(nèi)應(yīng)用，腺相關(guān)病毒（AAV）的有限包裝容量（約4.7 kb）是一大挑戰(zhàn)。常見的解決方案是將PE編碼基因分成兩部分，分別包裝到兩個AAV中，并在細(xì)胞內(nèi)通過內(nèi)含肽（intein）介導(dǎo)的蛋白質(zhì)連接進(jìn)行組裝，但效率低于全長PE。使用分裂PE（sPE），即將nSpCas9和MMLV-RT作為獨立組分遞送，無需內(nèi)含肽拼接，可能提高遞送效率。開發(fā)更緊湊的PE（如基于CjCas9的Mini-PE）以實現(xiàn)單AAV包裝，是另一個研究方向，但目前其編輯效率仍有待提升。

多項研究已使用AAV等載體在動物模型（如小鼠）中成功實施了prime editing，用于靶向編輯Dnmt1、Pah等基因，或治療鐮狀細(xì)胞貧血、萊伯先天性黑蒙癥等遺傳病模型。這些研究普遍報告了可觀的編輯效率（例如，使用AdV遞送可達(dá)58.2%），且通過深度測序未檢測到脫靶效應(yīng)。這表明prime editing在保持高精度的同時，具備體內(nèi)治療的潛力，為其未來走向臨床奠定了基礎(chǔ)。