《The Crop Journal》：CRISPR/Cas9 multiplex editing of four
TaSK41 genes increases grain size and weight and reveals a TaSK41–TaSnRK1β1 module associated with carbohydrate metabolism in wheat
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本研究針對小麥籽粒大小和重量（千粒重）作為產量關鍵性狀，但其調控網絡特別是糖原合成酶激酶3（GSK3）信號與碳水化合物代謝間的互作機制尚不明確這一核心問題，研究人員聚焦于小麥中OsSK41的同源基因TaSK41，利用CRISPR/Cas9多基因編輯技術，成功創制了四個TaSK41拷貝同時失活的四重突變體。研究結果表明，TaSK41是籽粒大小和重量的負調控因子，其功能缺失能通過促進外果皮細胞增殖、提升生長素（IAA/IBA）水平和增強淀粉積累，從而顯著增加粒重。更重要的是，研究首次揭示了TaSK41與能量感受激酶SnRK1的調控亞基TaSnRK1β1物理互作并促進其磷酸化，確立了TaSK41–TaSnRK1β1這一連接激酶信號與碳代謝的關鍵調控模塊。該研究為解析小麥籽粒發育的分子機制提供了新見解，并為通過分子設計育種提高小麥產量潛力提供了重要的基因和單倍型資源。
小麥，作為全球最重要的主糧作物之一，其產量的穩定與增長直接關系到糧食安全。然而，面對不斷增長的全球人口、頻發的極端氣候以及日益減少的耕地資源，提高小麥單產已成為一項緊迫挑戰。在構成小麥產量的三要素——單位面積穗數、每穗粒數和千粒重（TGW）中，籽粒大小和重量因其較高的遺傳力和表型穩定性，常被育種家們視為改良產量的重要靶標。盡管科學家們已經發現泛素化、生長素、油菜素內酯（BR）等多種信號通路參與調控籽粒發育，但一個關鍵的科學謎題依然懸而未決：這些復雜的信號網絡是如何與籽粒灌漿過程中至關重要的碳水化合物代謝相“對接”的？特別是糖原合成酶激酶3（GSK3）/SHAGGY-like激酶家族成員，它們在植物生長發育中扮演多重角色，但其在小麥籽粒發育中的具體功能和分子機制，尤其是如何影響碳源分配，仍然知之甚少。
為了解開這個謎團，并尋找提高小麥產量的新途徑，以張培培、楊德龍等研究人員為主的研究團隊，將目光投向了水稻中的一個“明星”基因——OsSK41（也稱OsGSK5）。該基因是調控水稻粒重和粒型的關鍵數量性狀位點（QTL）qTGW3的編碼基因，是一個已知的負調控因子。那么，它在小麥中的同源基因是否具有相似功能？其作用機制又是什么？圍繞這些問題，研究團隊在《The Crop Journal》上發表了一項系統性研究。
研究人員綜合運用了多種關鍵技術方法展開探索。首先，通過生物信息學比對和分子克隆，他們在六倍體小麥中鑒定出四個TaSK41基因拷貝（TaSK41-1A, -4A, -5B, -5D）。隨后，利用CRISPR/Cas9多重基因組編輯技術，成功培育了兩個獨立的四重突變體株系（task41-cr1和task41-cr2），實現了四個基因拷貝的同時功能缺失。研究還包含了細胞生物學分析（如外果皮細胞顯微觀察）、生理生化檢測（淀粉、可溶性糖及生長素含量測定）、分子互作驗證（酵母雙雜交Y2H、雙分子熒光互補BiFC、熒光素酶互補成像LCI、免疫共沉淀Co-IP及體內磷酸化分析）以及轉錄組學（RNA-seq）分析。此外，研究還利用了一個包含233份六倍體小麥種質的自然群體進行單倍型與性狀的關聯分析，以探究TaSK41基因的自然變異與農藝性狀的關系。
3.1. 小麥中TaSK41基因的分離與序列分析
研究人員成功分離出四個TaSK41基因拷貝，它們與水稻OsSK41高度同源，均編碼426個氨基酸的蛋白，并含有保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域。系統發育分析顯示這四個基因與OsSK41親緣關系密切。
3.2. TaSK41基因拷貝的亞細胞定位與表達分析
亞細胞定位實驗表明，TaSK41-5B蛋白同時定位于細胞質和細胞核。表達模式分析顯示，所有四個TaSK41拷貝在幼穗和發育早期（如開花后5天）的籽粒中表達量最高，尤其在籽粒的果皮等母體組織中優勢表達，這提示其功能可能與母體組織調控籽粒大小相關。
3.3. CRISPR/Cas9介導的TaSK41基因突變
研究團隊設計了兩條sgRNA，成功對四個TaSK41基因拷貝進行同步編輯，獲得了兩個純合的四重突變體。測序證實這些突變導致了移碼突變，預計使蛋白功能喪失。
3.4. TaSK41負調控小麥籽粒大小和重量
與野生型相比，兩個四重突變體均表現出顯著的表型變化：每穗粒數增加，籽粒更長、更寬、面積更大，千粒重（TGW）提升了12.1%至13.12%。同時，突變體籽粒中的淀粉含量顯著升高。這些結果直接證明TaSK41是小麥籽粒大小和重量的負調控因子。
3.5. TaSK41敲除系外果皮細胞數量增加
細胞學分析發現，突變體籽粒在發育早期（15 DAA）的外果皮細胞數量顯著多于野生型，而細胞長度無明顯差異。這表明TaSK41主要通過抑制外果皮細胞的增殖來限制籽粒大小。
3.6. TaSK41與TaSnRK1β1發生物理互作并使其磷酸化
這是本研究的核心發現之一。通過酵母雙雜交篩選，研究人員發現TaSK41與SNF1相關蛋白激酶1（SnRK1）的β調節亞基TaSnRK1β1存在互作。隨后通過BiFC、LCI和Co-IP等實驗在植物體內證實了二者的直接物理相互作用。更重要的是，Phos-tag凝膠 blot分析顯示，TaSK41能夠促進TaSnRK1β1在體內的磷酸化。這首次揭示了TaSK41–TaSnRK1β1這一將GSK3-like激酶信號與核心能量感受通路SnRK1聯系起來的關鍵模塊。
3.7. TaSK41通過調節植物激素途徑、細胞壁重塑以及蔗糖和淀粉代謝影響籽粒大小
轉錄組分析顯示，在task41突變體的發育籽粒中，大量與生長素信號、細胞壁重塑（如擴張蛋白基因）以及淀粉/蔗糖代謝相關的基因表達發生改變。同時，生理檢測證實突變體籽粒中的生長素（IAA和IBA）水平顯著升高，而可溶性糖（如蔗糖、葡萄糖）含量降低。這些變化與觀察到的淀粉積累增加、細胞增殖增強的表型相一致，共同解釋了籽粒增大的原因。
3.8. TaSK41-5B單倍型的關聯分析與地理分布
自然變異分析發現，在四個拷貝中，TaSK41-5B存在與TGW顯著相關的單倍型。研究人員開發了KASP分子標記，在233份小麥種質中鑒定出兩種單倍型：TaSK41-5B-HapI和HapII。關聯分析表明，攜帶HapI單倍型的小麥材料其TGW顯著高于攜帶HapII的材料。有趣的是，表達分析顯示HapI單倍型的TaSK41-5B表達水平較低，這與“TaSK41是負調控因子”的結論相吻合，表明HapI是利于提高粒重的優良等位變異。在中國主要麥區，HapI是優勢單倍型。
研究結論與意義
綜上所述，本研究系統闡明了TaSK41基因在小麥籽粒發育中的負調控作用。通過CRISPR/Cas9技術創制四重突變體，直接證明了敲除TaSK41能夠協同增加每穗粒數和千粒重，打破二者常存在的權衡關系，從而顯著提升產量潛力。在機制上，研究不僅驗證了TaSK41與TaARF4互作的保守性，更重要的是首次發現了TaSK41與能量代謝中樞SnRK1的調控亞基TaSnRK1β1互作并促進其磷酸化，建立了TaSK41–TaSnRK1β1這一全新的調控模塊。該模塊將上游的激酶信號與下游的碳水化合物代謝和分配直接聯系起來，為理解籽粒灌漿過程中信號轉導與物質積累的耦合機制提供了關鍵分子線索。
此外，針對TaSK41-5B開發的分子標記及其與高產性狀的關聯，為小麥分子標記輔助選擇（MAS）育種提供了切實可用的工具。因此，這項研究不僅深化了對小麥籽粒發育生物學基礎的認識，而且從基因資源、分子機制和育種標記三個層面，為未來通過遺傳改良策略定向提高小麥產量提供了重要的理論依據和實踐方案。
