RNA不僅是遺傳信息的載體，還通過復雜的三維結構參與催化與調控。在諸多RNA分子中，環狀RNA（circRNA） 以其閉合拓撲結構展現出高穩定性、低免疫原性和持久功能，因此在疫苗、核酸藥物和合成生物學等領域備受關注。然而，高效、規模化地制備高純度circRNA仍然是亟待突破的難題。利用核酶（ribozyme）自催化反應的PIE（permuted intron-exon）系統是目前較為高效的策略，其中源自T4噬菌體的td內含子（T4 td intron）是應用最廣的工具之一。但其環化的分子機制與結構基礎一直缺乏清晰解析。

2025年11月18日，中國科學技術大學生命科學與醫學部張凱銘/李珊珊課題組在Nature Catalysis雜志發表研究論文“Structural Insights and Engineering of T4 td Intron for Improved RNA Circularization”。本研究是課題組在核酶領域的又一重要研究突破（Nature 2021; PNAS 2022; Nucleic Acids Research 2023; Nature Communications 2023; Nature 2025）。     

 本研究利用冷凍電鏡（cryo-EM）分別解析了T4 td內含子在線性態與環狀態下的高分辨率結構，揭示了RNA環化過程中關鍵的結構重排與金屬離子作用機制：在環化過程中，催化核心堿基重新配對形成如U14-G37的新互作，同時P1ext螺旋結構消失；不同金屬離子在環化前后位置發生顯著變化，為環狀拓撲的穩定提供關鍵支撐；整體機制與I型核酶自剪接的第一步高度相似。

 基于上述的結構信息，研究人員鑒定出G37等關鍵核苷酸位點，并通過突變（U14C、G37A）顯著提高了線性內含子的環化效率。將優化突變引入T4 td-PIE系統后，在多種溫度條件下均顯著提升了目標RNA（如POLR2A、EGFP）的環化效率。更進一步，與 Anabaena-PIE系統 和 TRIC-V2策略等先進平臺的對比顯示，優化后的T4 td-PIE在效率與產物純度上均具備優勢。這一成果展示了結構生物學驅動RNA工程優化的強大潛力，為大規模、高純度circRNA生產提供了新路徑。

圖注：a.環狀 T4 td內含子的 3.3 ? 高分辨率冷凍電鏡結構；b.線性與環狀內含子中P1ext與P2區域的結構對比；c. T4 td內含子環化機制示意圖；d. G37A突變顯著提升 T4 td內含子的環化效率；e.在T4 td-PIE系統中，G37A 突變促進POLR2A circRNA的高效生成；f.結構指導下優化的T4 td-PIE突變體在環化效率上優于Anabaena-PIE 和 TRIC-V2 系統。

這項工作不僅為理解 RNA環化的分子機制提供了高分辨率結構基礎，也為 circRNA的規模化生產與應用提供了可行的工程化方案。研究成果有望加速circRNA在 疫苗研發、RNA藥物、合成生物學等領域的應用落地。

該研究工作獲得了國家自然科學基金委、科技部、中國科學院先導、合肥大健康研究院等基金項目的資助，以及獲得了細胞動力學教育部重點實驗室、中國科大冷凍電鏡平臺及附一院的大力支持。中國科學技術大學生命科學與醫學部博士研究生安林鳳為第一作者，李珊珊副教授和張凱銘教授為共同通訊作者。

原文鏈接:  https://www.nature.com/articles/s41929-025-01445-z