《International Journal of Biological Macromolecules》：CircTHBS1 stabilizes
N-acetyltransferase 10 to promote N4-acetylcytidine-dependent Rab8a translation and autophagy in esophageal squamous cell carcinoma
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本文聚焦于高致死性的食管鱗狀細胞癌(ESCC)。為解決其治療選擇有限且易復發的難題，研究人員探究了環狀RNA如何通過調控RNA乙酰化修飾影響腫瘤進程。研究發現，circTHBS1通過結合并穩定乙酰轉移酶NAT10，從而提升全局性ac4C修飾水平。這種修飾特異性富集于編碼區，并發現Rab8a是其關鍵靶點，其CDS區的CGCCAG基序的ac4C修飾增強了NAT10結合與Rab8a的翻譯效率，進而驅動自噬和腫瘤進展。該研究揭示了circTHBS1/NAT10-ac4C/Rab8a軸調控翻譯與自噬的新機制，為ESCC提供了新的機制見解與潛在治療靶點。
在消化系統惡性腫瘤的兇險譜系中，食管癌(Esophageal cancer, EC)始終占據著一席之地，而其中以東亞地區為主的食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)尤為致命。盡管診療技術不斷進步，但ESCC患者的總體預后依然不容樂觀，復發率和死亡率居高不下，這迫切需要我們深入挖掘其背后的核心分子驅動力。近年來，除了經典的基因突變，表觀遺傳修飾，尤其是RNA修飾，被發現是調控癌癥生物學行為的關鍵“幕后推手”。其中，一種名為N4-乙酰胞苷(ac4C)的RNA乙酰化修飾逐漸進入研究者視野。它由哺乳動物中目前已知的唯一RNA乙酰轉移酶——N-乙酰轉移酶10(N-acetyltransferase 10, NAT10)催化，能夠增強信使RNA的穩定性和翻譯效率。在包括胃癌、結直腸癌在內的多種癌癥中，已發現NAT10和ac4C的失調現象，提示它們可能是潛在的致癌因子。然而，在ESCC中，究竟是哪些上游分子在“指揮”NAT10并控制ac4C的修飾水平，這一機制尚不清晰。
與此同時，另一類明星非編碼RNA——環狀RNA(circular RNA, circRNA)因其獨特的閉環結構和多樣的調控功能，在癌癥生物學中嶄露頭角。越來越多的證據表明，circRNA能夠像“分子支架”一樣，結合RNA結合蛋白或修飾酶，從而影響m6A、m5C等RNA修飾，進而調控下游基因表達和細胞命運。那么，circRNA是否也能“插手”ac4C的調控，并在ESCC中扮演重要角色呢？這是一個充滿吸引力的科學問題。
為了解答這個謎題，南方醫科大學珠江醫院胸外科陳日新、謝丹、喬貴賓團隊的研究人員開展了一項深入研究，其成果發表在《International Journal of Biological Macromolecules》上。他們鎖定了一個名為circTHBS1（由THBS1基因第5號外顯子環化形成）的circRNA，系統揭示了其如何作為“上游指揮官”，通過穩定NAT10來全局性提升ac4C水平，并特異性增強關鍵自噬相關基因Rab8a的翻譯，最終驅動ESCC進展的全新軸系。
為開展此項研究，作者綜合運用了多種關鍵技術方法：首先，利用公共數據庫(GEO, CircRiC)和來自廣東省人民醫院(GDPH)與中山大學腫瘤防治中心(SYSUCC)的臨床樣本隊列進行circRNA篩選與表達驗證；其次，通過RNA下拉結合質譜、RNA免疫共沉淀(RIP)、免疫熒光-熒光原位雜交(IF-FISH)等技術確認了circTHBS1與NAT10的直接相互作用；再者，利用環己酰亞胺(CHX)追蹤、蛋白酶體抑制劑(MG132)處理及泛素化檢測等手段，闡明了circTHBS1穩定NAT10蛋白的分子機制；此外，研究還采用了ac4C點雜交、ac4C RNA免疫共沉淀測序(acRIP-Seq)來評估全局和特定位點的ac4C修飾變化；并通過嘌呤霉素標記、多聚核糖體分析技術評估整體及特定基因的翻譯效率；最后，借助透射電鏡(TEM)、mRFP-GFP-LC3雙熒光報告系統、以及裸鼠皮下移植瘤模型等，在細胞和動物水平上驗證了circTHBS1對自噬及腫瘤生長的調控功能。
研究結果層層遞進，揭示了完整的分子通路：
3.1. circTHBS1在ESCC中表達上調并促進ESCC細胞的惡性特性
通過對公共數據和臨床樣本的分析，研究人員發現hsa_circ_0034447（即circTHBS1）在ESCC組織和細胞系中顯著高表達，且其高表達與患者較差的組織學分級、T分期、淋巴結狀態以及不良的總生存期顯著相關。功能實驗表明，敲低circTHBS1能有效抑制ESCC細胞的增殖、遷移能力以及在裸鼠體內的成瘤能力；而過表達circTHBS1則產生相反的促癌效果。這些結果證實circTHBS1是一個在ESCC中發揮促癌作用的環狀RNA。
3.2. circTHBS1通過阻止蛋白酶體降解來穩定NAT10
為了探究circTHBS1的作用機制，研究人員通過RNA下拉結合質譜技術，成功捕獲到其關鍵互作蛋白——NAT10。隨后的RIP和IF-FISH實驗證實了兩者間的直接相互作用與核內共定位。機制研究發現，circTHBS1并不影響NAT10的翻譯，而是通過抑制其泛素-蛋白酶體途徑的降解，從而顯著延長NAT10蛋白的半衰期，維持其蛋白水平穩定。重要的是，敲低NAT10可以逆轉由circTHBS1過表達所引發的促增殖和促遷移效應，證明NAT10是circTHBS1發揮功能所必需的“下游執行者”。
3.3. circTHBS1通過NAT10介導的ac4C修飾促進全局mRNA翻譯
由于NAT10是ac4C修飾的關鍵催化酶，研究人員推測circTHBS1可能通過穩定NAT10來影響ac4C景觀。ac4C點雜交實驗證實，敲低circTHBS1會導致全局ac4C信號減弱。進一步的acRIP-Seq分析發現，ac4C修飾廣泛分布于mRNA的各個區域，且在敲低circTHBS1后，編碼區(CDS)的修飾變化最為顯著。已知CDS區的ac4C修飾主要影響翻譯效率。與此相符，嘌呤霉素標記和多聚核糖體譜分析均顯示，敲低circTHBS1后，細胞的整體蛋白質合成能力和多聚核糖體豐度均下降。這表明circTHBS1通過穩定NAT10，增強了全局性的翻譯效率。
3.4. circTHBS1通過NAT10-ac4C介導的翻譯調控驅動ESCC自噬
接下來，研究人員希望找到受此調控的具體功能靶點。通過整合mRNA-Seq和acRIP-Seq數據，他們篩選出一批轉錄水平穩定但ac4C修飾降低的候選mRNA。通路富集分析提示，這些基因顯著富集于“自噬”等相關通路。后續的蛋白印跡、mRFP-GFP-LC3報告系統和透射電鏡觀察一致證實：敲低circTHBS1會損害自噬流，表現為LC3-II/LC3-I比率降低、p62蛋白累積、自噬體/自溶酶體數量減少；而過表達circTHBS1則促進自噬。這表明circTHBS1通過ac4C修飾調控了自噬相關基因的翻譯，進而影響自噬過程。
3.5. circTHBS1通過NAT10介導的ac4C修飾促進Rab8a翻譯
從自噬相關的候選基因中，研究人員進一步聚焦于Rab8a。實驗驗證發現，Rab8a的mRNA水平不受circTHBS1影響，但其蛋白水平卻顯著下降。RIP和acRIP實驗證實，NAT10特異性結合并乙酰化Rab8a mRNA，且這一過程依賴于circTHBS1。多聚核糖體分析顯示，敲低circTHBS1后，Rab8a mRNA從活躍翻譯的“重多聚核糖體”部分向“非多聚核糖體”部分轉移，直接證明了其翻譯效率受損。因此，Rab8a被確定為circTHBS1/NAT10軸下游的關鍵翻譯調控靶點。
3.6. circTHBS1通過ac4C依賴的Rab8a通路調控自噬
研究人員在Rab8a mRNA的CDS區鑒定出一個保守的CGCCAG基序，該基序符合已知的ac4C修飾特征。RNA下拉實驗證明，NAT10僅與含有野生型CGCCAG基序的探針結合，而不與突變型探針結合，確認了該基序是NAT10識別和作用的關鍵位點。在功能拯救實驗中，回補野生型Rab8a能夠有效恢復因circTHBS1敲低而導致的自噬抑制、增殖和遷移能力下降；而回補無法被乙酰化的突變型Rab8a則無此效果。這強有力地證明了circTHBS1是通過NAT10對Rab8a mRNA特定基序的ac4C修飾來發揮其促癌功能的。
3.7. circTHBS1/NAT10軸與ESCC預后相關
臨床相關性分析顯示，在ESCC患者腫瘤組織中，circTHBS1的表達與NAT10及Rab8a的蛋白水平呈正相關，且兩者在組織中存在共定位。生存分析進一步表明，circTHBS1高表達且NAT10高表達的ESCC患者預后最差。在動物實驗中，使用NAT10抑制劑Remodelin處理，可以顯著抑制由circTHBS1過表達所促進的腫瘤生長。這些結果從臨床樣本和體內實驗兩個層面，證實了circTHBS1/NAT10/Rab8a軸在ESCC發生發展中的重要作用及其預后價值。
綜上所述，本研究系統性地揭示了一條全新的致癌通路：在ESCC中，高表達的環狀RNA circTHBS1通過直接結合并抑制乙酰轉移酶NAT10的泛素化降解，從而穩定NAT10蛋白水平；升高的NAT10進而催化全局mRNA（尤其是CDS區）的ac4C修飾增強，其中對自噬關鍵因子Rab8a mRNA特定CGCCAG基序的乙酰化，顯著提升了Rab8a的翻譯效率；最終，高水平的Rab8a蛋白驅動自噬進程，促進了ESCC的惡性進展。這一“circTHBS1/NAT10-ac4C/Rab8a”調控軸的發現，不僅將circRNA的功能范疇拓展至RNA乙酰化修飾領域，闡明了環狀RNA通過穩定修飾酶來重編程翻譯控制的新機制，而且為理解自噬在癌癥特別是ESCC中的作用提供了新的視角。更重要的是，該研究鑒定出的circTHBS1、NAT10以及ac4C修飾位點，均為ESCC的早期診斷、預后判斷以及開發靶向NAT10或Rab8a翻譯的新型療法提供了極具潛力的生物標志物和干預靶點，具有重要的理論意義與臨床轉化價值。
