體外模型為研究雞的免疫系統(tǒng)提供了寶貴數(shù)據(jù)。例如，研究者利用雞輸卵管原代細(xì)胞評(píng)估了新型重組啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效率，這在未來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因雞品系方面具有應(yīng)用前景。在DF-1（一種自發(fā)永生化雞成纖維細(xì)胞系）細(xì)胞中進(jìn)行的研究證實(shí)了CRISPR激活（CRISPRa）或抑制（CRISPRi）系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄研究中的有效性。此外，通過敲低和過表達(dá)受體相互作用蛋白激酶2（RIPK2），對(duì)HD11（來源于雞骨髓的巨噬細(xì)胞系）細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析揭示了其參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）-受體相互作用、粘著斑以及轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β信號(hào)通路等分子事件。

研究還表明，用益生菌（如枯草芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌）處理雞的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）具有免疫調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為白細(xì)胞介素-10（IL-10）和（C-C基序）配體5（CCL5）表達(dá)的增加。近期研究在鴨胚細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了鳥類中先前被認(rèn)為不存在的干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和干擾素調(diào)節(jié)因子9（IRF9），并證明它們對(duì)鴨細(xì)胞中干擾素介導(dǎo)的反應(yīng)及后續(xù)的干擾素刺激基因（ISGs）誘導(dǎo)至關(guān)重要。在DF-1細(xì)胞中過表達(dá)哺乳動(dòng)物的粘病毒抗性（Mx）基因能顯著降低禽流感病毒的復(fù)制。值得注意的是，DF-1細(xì)胞由于高表達(dá)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子1（SOCS1），其先天免疫反應(yīng)相較于雞胚原代成纖維細(xì)胞（CEFs）有所減弱，因此在解讀先天免疫相關(guān)數(shù)據(jù)時(shí)需要謹(jǐn)慎。

比較研究有助于理解水禽與家禽之間的差異，從而改善對(duì)宿主-病原體相互作用的認(rèn)識(shí)。例如，比較鴨和雞的血管內(nèi)皮細(xì)胞感染高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1后的先天免疫反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，雞的內(nèi)皮細(xì)胞在引發(fā)雞（而非鴨）的促炎細(xì)胞因子風(fēng)暴中發(fā)揮作用。感染HPAIV H5N6后，鴨的內(nèi)皮細(xì)胞感染程度也低于雞。研究還表明，H5N1能在鴨體內(nèi)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，感染后7-9天CD8⁺T細(xì)胞數(shù)量顯著上調(diào)。對(duì)H5N6禽流感病毒兩種不同基因型的比較發(fā)現(xiàn)，一組含有H9樣PB2和PB1基因的病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠中復(fù)制效率高，而另一組帶有H3樣PB1基因的病毒則偏好禽類細(xì)胞，且在水禽中傳播性更強(qiáng)。此外，對(duì)鴿子、烏鴉、雞和鴨等禽類物種感染H5N1的易感性進(jìn)行跨物種比較，揭示了一系列差異調(diào)節(jié)基因。對(duì)鴨感染強(qiáng)毒或弱毒H5N1毒株后的差異蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路高度參與，該通路已知負(fù)責(zé)生長調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和代謝。

雞為理解不同的免疫學(xué)功能做出了重要貢獻(xiàn)。CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了新的基因工程雞品系的產(chǎn)生，從而能詳細(xì)解析免疫系統(tǒng)。這體現(xiàn)在一系列重要基因工程雞的構(gòu)建上，包括敲除RAG1、敲除干擾素α和λ受體（IFNAR和IFNLR）、以及缺失αβ或γδ T細(xì)胞或兩者都缺失的品系。

研究人員通過磁激活細(xì)胞分選法分離胚胎第6天的雄性生殖腺，利用CRISPR/Cas9靶向RAG1的第一個(gè)外顯子，并結(jié)合帶有CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的tdTomato報(bào)告基因的供體質(zhì)粒，通過G418抗生素篩選，成功產(chǎn)生了RAG1敲除雞。這些缺乏RAG1的雞存在免疫缺陷，并表現(xiàn)出適應(yīng)性免疫細(xì)胞發(fā)育的改變，包括胚胎期V(D)J重組中斷、免疫球蛋白水平降低以及T和B細(xì)胞成熟受阻。后續(xù)研究利用RAG1 KO雞鑒定出雞體內(nèi)存在兩個(gè)自然殺傷（NK）細(xì)胞亞群（NK-1和NK-2），與人類和小鼠中的類似，揭示了跨物種進(jìn)化保守的免疫機(jī)制。

研究還細(xì)致地闡明了αβ或γδ T細(xì)胞在雞中的作用。利用同源定向修復(fù)（HDR）技術(shù)分別刪除了γ或β鏈的恒定區(qū)。刪除αβ T細(xì)胞導(dǎo)致了嚴(yán)重的免疫表型，表現(xiàn)為脾臟和腺胃出現(xiàn)肉芽腫和炎癥，且γδ T細(xì)胞未能對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)償。出乎意料的是，刪除γδ T細(xì)胞并未導(dǎo)致明顯的免疫表型，這說明了αβ T細(xì)胞在雞免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。最近的研究探討了γδ T細(xì)胞在高毒力馬立克氏病病毒（MDV）感染中的作用。缺乏γδ T細(xì)胞導(dǎo)致MDV在胸腺和脾臟中大量復(fù)制，并與病毒誘導(dǎo)的腫瘤高發(fā)生率相關(guān)，結(jié)論是雞體內(nèi)的γδ T細(xì)胞在MDV的致病機(jī)制中扮演著關(guān)鍵角色。

此外，缺乏Tetherin/BST2的雞在感染原型禽逆轉(zhuǎn)錄病毒后，表現(xiàn)出比野生型（WT）雞顯著更高的病毒血癥，這首次揭示了該基因在鳥類呼腸孤病毒致病機(jī)制中的作用。通過構(gòu)建XCR1-iCaspase9-RFP雞，可視化并消融了XCR1⁺常規(guī)樹突狀細(xì)胞（cDCs），揭示了關(guān)于雞常規(guī)樹突狀細(xì)胞的新數(shù)據(jù)。研究表明，敲除趨化因子受體XCR1會(huì)阻止cDCs與CD8⁺T細(xì)胞的聚集。最近，I型和III型干擾素受體敲除雞的產(chǎn)生揭示了關(guān)于禽類免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵見解。研究發(fā)現(xiàn)I型干擾素調(diào)節(jié)先天免疫細(xì)胞群以及T細(xì)胞，并影響抗體產(chǎn)生。利用不同甲型流感病毒亞型進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)揭示了干擾素在病毒致病機(jī)理、免疫反應(yīng)和組織嗜性效應(yīng)中的重要作用。

從對(duì)傳染性病原體敏感性較低或有抗性的鳥類物種中獲取知識(shí)已被證明非常有益。例如，基于其他對(duì)禽白血病病毒J亞群（ALV-J）具有天然抗性的鳥類中發(fā)生的自然突變，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞的Na⁺/H⁺交換器1型（chNHE1）中特異性誘導(dǎo)單個(gè)氨基酸突變，這一遺傳修飾影響了ALV-J的細(xì)胞附著，使雞獲得了對(duì)該病毒的抗性。這證明了基于自然突變、利用基因組編輯獲得對(duì)病原體抗性的有效性。同樣，針對(duì)感染細(xì)胞多肽-4（ICP4）等基因靶點(diǎn)，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因雞，其MDV復(fù)制率顯著低于野生型雞。

禽流感病毒的病毒庫是野生鳥類，特別是鴨子，盡管能有效復(fù)制病毒，但表現(xiàn)出的臨床癥狀比雞或其他雞形目鳥類輕微。長期以來，人們認(rèn)為鴨子能作為病毒庫主要與其表達(dá)視黃酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）有關(guān)，而該基因在雞和其他雞形目鳥類中已進(jìn)化丟失。在雞中重新引入RIG-I及其泛素化因子RNF135，揭示了一系列生理和病理方面的發(fā)現(xiàn)。在未感染鳥類中，重新表達(dá)RIG-I導(dǎo)致了適應(yīng)性免疫反應(yīng)的改變。然而，用強(qiáng)毒流感毒株進(jìn)行的體內(nèi)攻毒實(shí)驗(yàn)卻導(dǎo)致了高死亡率，這與有害的炎癥反應(yīng)相關(guān)。例如，感染H3N1的RIG-I表達(dá)雞，其IL-1β、IL-6、IFN-α和IFN-γ的表達(dá)量顯著高于其他感染雞。這項(xiàng)研究還揭示，病毒庫與禽流感之間獨(dú)特的相互作用并非僅因RIG-I的存在，還可能與其他尚未識(shí)別的因素有關(guān)。例如，在鴨胚成纖維細(xì)胞中，鴨RIG-I與坦布蘇病毒的相互作用研究表明，TRIM35會(huì)阻礙鴨TRIM25介導(dǎo)的鴨RIG-I泛素化，從而促進(jìn)病毒復(fù)制。RIG-I與病毒的相互作用可能具有物種依賴性。先前研究表明，禽流感病毒的NS1蛋白能抑制人RIG-I的泛素化，但對(duì)鴨RIG-I則無此作用。

培育對(duì)禽流感病毒具有抗性或低敏感性的雞面臨著挑戰(zhàn)，主要與難以找到合適的宿主因子以及病毒的高突變率有關(guān)。必須指出，任何針對(duì)禽流感抗性的培育都必須極其謹(jǐn)慎，因?yàn)榇嬖谶m應(yīng)性突變的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，甲型流感病毒每個(gè)復(fù)制基因組平均包含2-3個(gè)突變，這可能導(dǎo)致逃逸突變株的出現(xiàn)。

在培育抗禽流感雞方面，一項(xiàng)基礎(chǔ)性研究聚焦于酸性核磷蛋白，特別是酸性（富含亮氨酸）核磷蛋白32家族成員A（ANP32A）。Long等人描述了哺乳動(dòng)物和雞ANP32A序列的差異，以及富含亮氨酸重復(fù)序列和羧基末端低復(fù)雜度酸性區(qū)域結(jié)構(gòu)域之間33個(gè)氨基酸的缺失如何影響禽病毒聚合酶的功能。這些觀察結(jié)果為通過靶向ANP32基因家族培育抗禽流感感染的雞奠定了基礎(chǔ)，該家族支持病毒基因組在宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。在低劑量H9N2病毒攻擊下，大多數(shù)編輯雞未被感染。然而，高劑量感染則導(dǎo)致突破性感染，使得病毒能夠適應(yīng)經(jīng)過編輯的雞ANP32A（通過引入N129I和D130N兩個(gè)氨基酸取代產(chǎn)生）。此外，完全移除雞ANP32A驅(qū)動(dòng)病毒向其他酸性核磷蛋白（包括雞ANP32B和ANP32E）適應(yīng)。作者得出結(jié)論，實(shí)現(xiàn)完全免疫似乎具有挑戰(zhàn)性，可能需要多基因的遺傳修飾。Sheppard等人的研究證實(shí)了這些觀察結(jié)果，他們報(bào)告稱，僅在缺失ANP32A和ANP32B的人源細(xì)胞中傳代兩次后，禽流感病毒的復(fù)制即達(dá)到高水平。

未來在禽流感抗性領(lǐng)域的努力可能側(cè)重于靶向參與病毒復(fù)制的雞細(xì)胞因子。這可能包括Sec61，它負(fù)責(zé)流感病毒蛋白（如HA）的生物合成。這曾在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行過研究，部分敲除或化學(xué)抑制Sec61會(huì)選擇性損害流感病毒以及HIV和登革熱病毒的糖蛋白穩(wěn)態(tài)。

自CRISPR/Cas9發(fā)現(xiàn)以來，以及得益于原始生殖細(xì)胞（PGCs）長期培養(yǎng)和遺傳修飾技術(shù)的顯著優(yōu)勢，家禽生物技術(shù)工具的研究空白正在被填補(bǔ)。這體現(xiàn)在一系列作為免疫學(xué)研究模型的基因工程鳥類的產(chǎn)生，以及為預(yù)防感染提供新解決方案的其他品系上。新的有前景的研究正在進(jìn)行，旨在探索和建立來自不同物種（如鵝和鴿子）的PGC培養(yǎng)體系。家禽研究也應(yīng)更多地將雞作為比較病理學(xué)模型，這將增進(jìn)我們對(duì)宿主-病原體相互作用的基本機(jī)制及相關(guān)進(jìn)化機(jī)制的理解。

當(dāng)前H5N1形勢帶來的持續(xù)健康風(fēng)險(xiǎn)，要求我們基于基因組編輯開發(fā)新的解決方案，以更好地理解宿主-病原體相互作用并預(yù)防感染。然而，必須考慮可能發(fā)生的適應(yīng)性突變，并持續(xù)評(píng)估其致病潛力。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)可能需要多基因編輯以及新的遞送和疫苗接種工具，包括使用病毒樣顆粒（VLPs），以兼顧效率與生物安全性。

公眾對(duì)消費(fèi)基因修飾動(dòng)物產(chǎn)品的看法很可能在未來數(shù)年里持續(xù)引發(fā)爭論。但我們認(rèn)為，這個(gè)問題應(yīng)根據(jù)基因修飾本身進(jìn)行個(gè)體化評(píng)估。以往的育種策略曾成功培育出對(duì)球蟲病和馬立克氏病具有抗性的品種。因此，基于從低敏感性物種收集的遺傳信息，精心規(guī)劃精準(zhǔn)的基因組編輯，可能會(huì)提供強(qiáng)大的健康解決方案，正如先前原理驗(yàn)證性研究所展示的那樣。